ارتفاع العائد ونظام التعبير التكلفة ذات كفاءة من Granzymes الإنسان في خلايا الثدييات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج غلة عالية من الجرانزيم الفوليك الغليكوزيلات والنشطة إنزيميا في الكلى الجنينية البشرية 2 93 الخلايا التائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق توسيع خلايا HEC 2 93 T أولا في أطباق زراعة الأنسجة المناسبة. يتكون حجم التحضير المعتاد بعد التوسع من 20 إلى 25 طبقا ثقافيا.

الخطوة الثانية هي نقل الخلايا الموسعة بشكل عابر باستخدام بلازميد تعبير الجرانزيم باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم الفعالة. بعد ذلك ، يتم حصاد الخلية السوبرnat ويتم تنقية الإنزيمات الكبرى المفرزة عن طريق كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة. تتمثل الخطوات الأخيرة في تنشيط الإنزيمات الكبرى عن طريق إدخال علاج كيناز وزيادة تنقية البروتياز عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني.

في النهاية ، يتم اختبار النشاط الأنزيمي باستخدام مقايسة مترية سريعة وموثوقة حيث أن توافر البروتياز النشط بكميات كافية هو عامل مقيد في أبحاث الجرانزيم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في هذا المجال ، مثل توصيف مسارات موت الخلايا الجديدة في الكائنات الحية المختلفة ، أو تحديد ركائز البروتياز الجديدة في مناهج البروتيوم الكاملة للتعبير عن الإنزيمات الكبرى. قم أولا بزراعة خلايا HEC 2 93 T في 20 مل من وسط الاستزراع ، باستخدام أطباق زراعة الأنسجة 150 × 25 ملم ، تقسم الخلايا عند 80٪ من خلايا الطلاقة المشتركة المرتبطة بشكل فضفاض ، ولكن يمكن فصلها ميكانيكيا بدون التربسين عن طريق ماصة اللوحة لأعلى ولأسفل.

الخلايا في الليلة السابقة للتعداء لإعطاء 60 إلى 70٪ من الطلاقة المشتركة في يوم التعدي. يتكون حجم التحضير المعتاد من 20 إلى 25 طبقا ثقافيا. قبل ساعة واحدة من التعدي ، غيرت وسط الاستزراع القياسي إلى 20 مل من وسط التعداء بالقرب من نهاية خطوة الحضانة لمدة ساعة واحدة ، خلط 400 ميكروغرام من الحمض النووي للبلازما مع 10.95 مل من الماء المقطر المزدوج و 1.55 مل من كلوريد الكالسيوم المولي في أنابيب سعة 50 مليلتر قبل دقيقة إلى دقيقتين من التعدي.

عند 12.5 مل من أكوام x ، تم تخزين محلول ملحي إلى 12.5 مل من محلول الكالسيوم الحمض النووي الممزوج عن طريق انعكاس الأنابيب قبل الحضانة لمدة 30 ثانية. في درجة حرارة الغرفة ، أضف هذا الخليط ، بالتنقيط مباشرة إلى الخلايا بمعدل خمسة ملليلتر لكل طبق ، ورشيه بالتساوي على المنطقة بأكملها ، مع تحويل الوسط إلى اللون البرتقالي قليلا. احتضان أطباق الاستزراع لمدة سبع إلى 11 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة.

بعد الحضانة ، يظهر راسب ناعم. قم بإزالة وسيط التعداد. اشطفها بعناية باستخدام PBS الدافئ وأضف 20 مل من وسط المزرعة الخالية من المصل قبل الحضانة لمدة 72 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة ، وقم بتحليل كفاءة التعداء والتعبير عن طريق تشغيل عينة من المادة الطافية للخلية على صفحة SDS وتلطيخها باستخدام كوماسي.

أزرق لامع. لتصور فرقة الجرانزيم. بعد الحضانة صب الخلية ثقافة طافية داخل 250 [ملليتر] أنابيب ومسح بالطرد المركزي.

قم بإجراء الدوران الأول الذي من شأنه إزالة الوسط من الخلايا المنفصلة. انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 250 مليلتر وتدور عند 4,000 Gs لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة أي بقايا خلية متبقية. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من كلوريد الصوديوم ، و 6.25 مل من قاعدة تريس ومليلتر واحد من كبريتات النيكل بالإضافة إلى 250 مل من المادة الطافية التي تم تطهيرها.

قم بتصفية المادة الطافية باستخدام وحدة تصفية فراغ سعة 500 مل. قم بتوازن عمود كروماتوغرافيا تقارب أيون معدني ثابت بالنيكل مع عازلة الربط. أ باستخدام نظام FPLC مناسب.

ثم ضع المادة الطافية التي تم تطهيرها على العمود المتوازن بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد تطبيق المادة الطافية ، اغسل العمود بمخزن البند الملزم حتى يتم الوصول إلى خط الأساس الماص للأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة فوق البنفسجية. قم بتقطيع الجرانزيم بتدرج خطي 20 مليلتر ILE بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة أثناء جمع جزأين من المليلتر.

تحليل الكسور الإيلوسي عن طريق صفحة SDS وتلوين كوماسي. اسحب الزيم الكبير الذي يحتوي على كسور في أنبوب مزعج. قم بتخزين عينة صغيرة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر كعنصر تحكم ما قبل الأمعاء كيناز.

أضف كيناز الأمعاء بمعدل 0.02 وحدة لكل 50 مل من المادة الطافية الأولية مباشرة إلى الجزء المجمع في أنبوب غسيل الكلى وغسيل الكلى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت المعوي كيناز. في اليوم التالي ، قم بتحليل كيناز المعالج بجراند مقارنة بالتحكم في كيناز ما قبل الدخول بواسطة صفحة SDS وتلوين كوماسي الأزرق. عند اكتمال المعالجة الطرفية النهائية.

قم بتغيير المخزن المؤقت لغسيل الكلى إلى S buffer A وقم بغسيل الكلى لمدة أربع ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة قبل تصفية DIALATE الثمانية. بعد ذلك ، قم بموازنة عمود S مع المخزن المؤقت S. أ- قم بتحميل العينة على العمود بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة عند أربع درجات مئوية بعد تحميل العينة.

اغسل العمود باستخدام المخزن المؤقت S A حتى يتم الوصول إلى خط الأساس الماص للأشعة فوق البنفسجية. قم بإزالة الجرانزيم بتدرج كلوريد الصوديوم الخطي 30 ملليلتر جرانزيم أ عند حوالي 650 ملليمولار كلوريد الصوديوم الجرانزيم B عند حوالي 700 ملليمولار كلوريد الصوديوم والجرانزيم M عند حوالي 750 مللي مولار كلوريد الصوديوم. قم بتجميع الكسور التي تحتوي على الجرانزيم والتركيز على حوالي 100 ميكرومولار في مرشحات الدوران ، وقم بتخزين مستحضرات الجرانزيم المركزة وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد ذلك ، قم بتحليل الكسور الإيلوسيانية بواسطة صفحة SDS والمقايسات المترية للكول لإجراء فحوصات مترية الكول لتوزيع عينات الجرانزيم الصغيرة من الكسور الإليلوسية أو المخزونات المركزة في 96. تشتمل الألواح المسطحة على تحكم إيجابي وتحكم سلبي. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص لكل منها.

حسنا ، احتضن الطبق لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 405 نانومتر في قارئ الألواح الدقيقة. سينتج هذا البروتوكول عوائد عالية من الجرانزيم النقي كما هو موضح في هلام صفحة SDS الملون بالكوماسي التمثيلي الذي يعرض الجرانزيم BE من عمود S.

تظهر الجرانزيم المؤتلف نشاطا مشابها لمستحضرات البروتياز الأصلي كما هو موضح في هذا الاختبار المتري للألوان الذي يقارن نشاط الجرانزيم المؤتلف والأصلي. الأهم من ذلك ، يشير علاج endo H إلى أن الجرانزيم المنتج في خلايا HEC 2 93 T يتم غليكوزيله بالكامل. الإنزيمات الكبرى المؤتلفة قادرة على شق ركائز البروتين الجزيئي كما هو موضح في هذا الجرانزيم التمثيلي ، وهو اختبار انقسام باستخدام ركيزة البروتين البكتيري و UOCD.

هنا ، يختفي الشريط الذي يمثل N-O-U-C-D المشقوق ببطء مع زيادة تركيز الجرانزيم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج إنزيمات كبيرة نشطة بالكامل ونشطة بإنتاجية عالية في خلايا HK 2 93 T.