متلازم متحد البؤر و3D المجهر الإلكتروني لخلية حسية معينة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توثيق البنية الفائقة الكاملة لخلية حسية معينة في الأمعاء منتشرة بين الخلايا الظهارية الأخرى في أنسجة الأمعاء الأصلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على جزء من الأنسجة 300 × 50 ميكرون من الأمعاء. التالي يتم الحصول على مداخن Z البصرية للجزء باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

ثم تعمل البيانات متحد البؤر كدليل لمعالجة الأنسجة وتصويرها باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي أو SBEM. أخيرا ، يتم تقسيم بيانات SBEM لتقديم البنية الفائقة لخلية مستشعر أمعاء معينة في 3D. في نهاية المطاف الفحص المجهري متحد البؤر المترابط ومسح وجه الكتلة التسلسلية.

يستخدم المجهر الإلكتروني لإظهار خلية معينة في أنسجتها الأصلية والكشف عن هيكلها الفائق في 3D. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل التفاعلات المحددة بين الخلية والخلية التي لا يمكن تصورها بطريقة أخرى على مستوى المجهر الضوئي. باستخدام هذه الطريقة ، أبلغنا سابقا عن علاقة كيميائية فيزيائية خفية بين دخول الخلايا الحسية إلى خلايا الغدد الصماء وإدخال ggl.

بعد عزل القولون الماوس ، وفقا لبروتوكول النص ، ضعه في PBS بارد لطيف ، وأثناء غمره ، قم بقطع الأنسجة المفتوحة على طول المساريق ، وانقل الأنسجة إلى بضع قطرات من PBS على ورقة من شمع الأسنان وباستخدام مشرط حول ستة أجزاء صغيرة من الأنسجة من القولون البعيد. بعد تحضير 5٪ من الذوبان المنخفض في PBS ، استخدمه لتضمين أجزاء الأنسجة في حاوية بلاستيكية صغيرة مثل قالب التبريد بتقنية الأنسجة بالحجم القياسي ، وقم بتركيب الأقسام المضمنة على ميكروتوم ذو شفرة اهتزازية واستخدم PBS المثلج البارد لملء الدرج العازل. ثم قم بقص شرائط أنسجة 300 ميكرون بسعة 0.8 وسرعة 0.04 ملم في الثانية.

قم بقصب شرائط الأنسجة 300 ميكرون في aros وقم بتثبيتها على ميكروتون بشكل عمودي على الشفرة. ثم قم بقص شرائط الأنسجة بسمك 50 ميكرون ، مع الإشارة إلى بروتوكول النص للحصول على التفاصيل قبل تخزين الكتل في PBS عند أربع درجات مئوية. بعد تصوير كتل الأنسجة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وفقا لبروتوكول النص للتسلل وتضمين أقسام الأنسجة في الراتنج.

قم بإزالة الأنسجة من PBS واستخدم 0.1 مولار الطبقة المؤقتة لشطفها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. بمجرد تحضير الراتنج وتلطيخ الأنسجة للفحص المجهري الإلكتروني ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدمه لتجميع كتل الأنسجة بين الشرائح الزجاجية المعالجة بعامل إطلاق سائل بعد تضمين كتل الأنسجة ، ومعالجة الكتل بشكل مسطح لمدة 48 ساعة إضافية عند 60 درجة مئوية. ثم اسحب الشرائح بعيدا عن بعضها لتحرير الكتل تحت نطاق تشريح ، ومطابقة اتجاه كتل الأنسجة المضمنة في الراتنج مع اتجاه الصور المجهرية متحدة البؤر.

لتسهيل تحديد المناطق التي تحتوي على الخلايا ذات الأهمية ، قم بتركيب الكتلة بشكل مسطح على دبوس يحتوي على إيبوكسي موصل وجففه لمدة 30 دقيقة. ثم ضع الكتلة بشكل مسطح على سطح وجفف طوال الليل عند 60 درجة مئوية في اليوم التالي. قم بتغطية الكتلة بسائل الفضة الغروية.

حافظ على أقسام الأنسجة بشكل مسطح لضمان تقطيع الكتلة بالزاوية اليمنى لتسهيل ربط وجه الكتلة التسلسلية والصور المجهرية متحدة البؤر. بعد إجراء الفحص المجهري الإلكتروني المسح الضوئي وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحويل صور SPEM من تنسيق DM الخام بثلاثة إلى صور TIFF بثمانية بت باستخدام مرشح ضبابية غاوسي 0.8 في فيجي. تصفية صور TIFF.

قم بتقليص حجم مجموعة البيانات إلى 25٪ من الحجم الأصلي واحفظها كمكدس TIFF لتقليل مقدار ذاكرة الوصول العشوائي اللازمة للتعامل مع مجموعة البيانات باستخدام محاذاة المكدس الخطي للمكون الإضافي Fiji مع التدقيق في وضع الترجمة. قم بمحاذاة مجموعة صور SPEM واستخدم المكون الإضافي 3D للاقتصاص لاقتصاصها. لعرض البيانات ، استخدم أداة الأسطح في وضع الرسم وخيار الكفاف في وضع الرسم لمدة 50 مللي ثانية لتقسيم الخلية محل الاهتمام وحجمها يدويا.

تتبع الخطوط على كل شريحة من الخلية للحصول على عرض أكثر سلاسة أو كل خمس شرائح لعرض أسرع. استخدم أداة اللقطة لتصدير الصور النهائية بدقة 300 نقطة في البوصة أو أكثر باستخدام الماوس P-Y-Y-G-F-P. يتم تحديد جميع خلايا الغدد الصماء المعوية في الجزء البعيد من الأمعاء الدقيقة ومعالجتها ل SBEM كما هو موضح هنا.

تم تصوير جزء من الأنسجة المختار عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للحصول على صور Zack ، والتي تكون متباعدة بصريا بميكرون واحد. يعد تحسين أبعاد كتل الأنسجة أمرا بالغ الأهمية للارتباط الطبوغرافي بين بيانات البؤر وبيانات SBEM. يظهر هذا المجلد المعروض لخلية الغدد الصماء المعوية في دقاق الفأر جراب عصبي بارز ممتد تحت الخلايا الظهارية حوالي 60 ميكرون.

من خلال ربط مكدسات Z متحدة البؤر مع صورة SBEM لوجه الكتلة بأكمله ، يتم تحديد الخلية محل الاهتمام هنا في كتلة من القولون البعيد لماوس A-P-Y-Y-G-F-P. من المهم الحفاظ على اتجاه الكتلة مسطحا قدر الإمكان لمطابقة الشرائح البصرية في صور SBEM. بمجرد تحديد الخلية ، يتم إجراء تصوير SBEM بدقة عالية بما يكفي لتحديد الألواح الإفرازية وعضيات الخلايا الأخرى.

يحتوي هذا الفيديو على عرض ثلاثي الأبعاد لخلية الغدد الصم المعوية. تحتوي مجموعة البيانات على 643 صورة تمتد على 45 ميكرون من عمق الأنسجة. تحتوي الخلية على جراب عصبي مليء بالزغابات الإفرازية وكذلك الزغابات الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توثيق البنية الفائقة الكاملة لخلية حسية معينة في الأمعاء تنتشر بين الخلايا الظهارية الأخرى في أنسجة الأمعاء الأصلية باستخدام التألق كدليل لتحديد الخلية أو الخلايا ذات الأهمية ومعالجة الأنسجة للفحص المجهري الإلكتروني لمرحلة الكتلة التسلسلية.