التصور المناعى من الحصين العصبية آخر بعد المكانية التعلم في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف التغيرات في فسفرة الحصين بعد التعلم المكاني في فئران Grailed اثنين بالضربة القاضية كنموذج لاضطرابات النمو العصبي. يتم تحقيق ذلك من خلال الاختبار الأول لكل من النوع البري وفي الكأس اثنين من الفئران بالضربة القاضية في متاهة موريس المائية. كخطوة ثانية ، تتم إزالة أدمغة الفئران ويتم تحضير شرائح من الفئران البرية والضربة القاضية عن طريق قطع viome.

بعد ذلك ، تتم معالجة شرائح الدماغ من الفئران البرية والضربة القاضية من أجل الكيمياء المناعية واستخدامها للكشف عن تغيرات الفسفرة في الحصين. تظهر النتائج اختلافات في فسفرة الحصين RC بين النوع البري وفي الكأس فأرين بالضربة القاضية بناء على التصور المجهري الضوئي للتلوين الكيميائي المناعي. تسمح هذه الطريقة بتحديد مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية في الحصين التي يتم تنشيطها بعد مهمة تعليمية خاصة تعتمد على الحصين مثل متاهة موریس المائية.

أضفنا أولا فكرة هذه الطريقة عندما قررنا التحقيق في الشلال الجزيئي الذي يؤكد العجز الجزيئي في الفئران بالضربة القاضية من الدرجة الثانية ، وهو نموذج فأر لاضطرابات طيف التوحد. للبدء في تدريب الفئران من خلفيات مختلفة ذات أهمية في مهمة التعلم المكاني مثل Morris Water Mae. اتبع نظام التدريب كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب في نهاية فترة التدريب ، وقتل الفئران رحيما ثم قم بإصلاح أدمغتها وإزالتها.

عندما تكون جاهزا لمواصلة الإجراء، استخدم مشرطا لإزالة المخيخ. ثم قم بلصق بقية الدماغ في وضع مستقيم على لوحة حامل الاهتزاز. قطع الدماغ إلى أقسام تسلسلية بسمك 20 إلى 40 ميكرون في جميع أنحاء الحصين الظهري.

انقل كل شريحة إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا مملوءة بمليلتر واحد من 0.1 مولار PBS ، ونقل ثلاثة إلى خمسة أقسام حصين ظهرية لكل فأر إلى آبار صفيحة متعددة الآبار 24 تحتوي على 500 ميكرولتر من 0.1 مولار PBS لكل منها. اغسل جيدا الأقسام الموجودة في كل بئر ب 500 ميكرولتر من 0.1 مولار PBS ، وقم بإجراء جميع الغسالات والحضانات في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف ما لم يذكر خلاف ذلك. تحت غطاء الدخان ، احتضان الأقسام في 40٪ ميثانول ، 1٪ بيروكسيد الهيدروجين في 0.1 مولار PBS لمدة 20 دقيقة من أجل إخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي.

بعد ثلاث غسلات أخرى في 0.1 مولار PBS ، قم بحفر الأقسام عن طريق احتضانها في 500 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X 100 لمدة خمس دقائق أثناء احتضان الأقسام ، قم بإعداد مخزن مؤقت مانع كاف للتجربة بأكملها. ثم قم بإزالة المحلول المنفذ وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل منهما. حسنا احتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع وقم بتغطية الأقسام بالكيناز المنظم خارج الخلية الفسفوري. تم تخفيف الجسم المضاد الأولي من واحد إلى 500 في المخزن المؤقت المانع. احتضان الأقسام طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف في اليوم التالي بعد غسل الأقسام ثلاث مرات في 0.1 مولار PBS لمدة خمس دقائق.

كل يحتضن الأقسام بجسم مضاد ثانوي مترافق مع البيوتين مخفف من واحد إلى 250 في مانع المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أثناء الحضانة. قم بإعداد كاشف A BC قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام لإتاحة الوقت الكافي لتكوين مركب عدن والبيوتين. بعد غسل الأقسام ثلاث مرات أخرى باستخدام 0.1 مولار PBS ، أضف كاشف A b و C واتركه يحتضن مع العينة لمدة 45 دقيقة.

خلال المجموعة التالية المكونة من ثلاث غسلات في PBS ، قم بإعداد حل عمل DAB في غطاء الدخان وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ، مع إضافة محلول عمل DAB في اللوحة. ثم انقل الأقسام إلى الآبار التي تحتوي على محلول عمل DAB وقم بتدوير اللوحة ببطء للسماح بأقصى قدر من التعرض للأقسام للمحلول. راقب تفاعل DAB على المجهر حتى تتطور الإشارة الكافية.

في حوالي دقيقتين إلى خمس دقائق ، أوقف التفاعل بكثافة اللون المطلوبة عن طريق غسل الأنسجة في 0.1 مولار PBS. بعد ثلاث غسلات أخرى في PBS ، قم بتركيب الأقسام على شرائح مغلفة بالجيلاتين وجففها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات على الأقل. بمجرد تجفيف الهواء ، ينزلق النقل في غطاء الدخان ويجفف الأقسام عن طريق وضعها بالتتابع في محاليل الإيثانول المتكاملة لمدة دقيقتين لكل منهما ، ثم امسح الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة خمس دقائق.

قم بتغطية الشرائح وانزلقها باستخدام وسيط التثبيت واتركها في غطاء الدخان طوال الليل لتجف ، انقل الشرائح إلى مجهر المجال الساطع ، مزود بكاميرا وعدسة موضوعية 20 ×. احصل على صور متعددة للمجال الساطع من كل قسم بتكبير 200 × تغطي صورة الحصين الظهري. ثلاثة إلى خمسة أقسام من كل.

تظهر هنا أقسام من مناطق فرس النهر الظهرية لفأر من النوع البري وفأر خروج المغلوب ملطخ بالفسفرة. تنظيم خارج الخلية قراءة جزيئية موثوقة للتنشيط العصبي المعتمد على التعلم. خضع كل من هذين الفئران لنظام مهام التعلم المكاني الكلاسيكي المعتمد على الحصين ، متاهة موريس المائية قبل التضحية.

في اليوم الأخير من الاختبار ، أظهر الفئران بالضربة القاضية Grailed عجزا كبيرا في التعلم المكاني مقارنة بالفئران البرية. لتحليل شرائح الدماغ من الفئران ، تم حساب العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية في جميع أنحاء مناطق الحصين المختلفة. في طبقة CA ثلاثية المعلمات ، كان لدى الفئران البرية خلايا موجبة RK فسفرة أكثر بكثير في كل منطقة مقارنة بالفئران بالضربة القاضية.

تم العثور على نتائج معاكسة في طبقة الخلية الحبيبية والحبيبية أو GCL. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في تركيبة الفوس على شرائح الدماغ من الحصين لكل من نماذج الفئران الجينية والدوائية لاضطرابات النمو العصبي التي تتميز بالعجز المعرفي. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لدراسة تغييرات صياغة قوة الإزعاج في مناطق الدماغ الأخرى ، بالإضافة إلى اتباع المهام السلوكية المعرفية المختلفة عن متاهة موريس ووتر.

لا تنس أن العمل مع DIA benzine يمكن أن يكون هاربا للغاية ووفقا للاحتياطات ، مثل ارتداء الحماية المناسبة يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.