إعداد سطحي والفعال للGlycopolymers نيون ثلاثي مكون عبر تسيطر عليها RAFT البلمرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو التخليق المحكوم بدقة لبوليمرات جليكوبوليمر خطية إحصائية فلورية باستخدام بلمرة نقل السلسلة بـ إضافة وتجزئة عكسية، أو بلمرة RAFT. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تخليق المونومر الجليكوزي 2-لاكتوبيو-إيثيل ميثاكريلاميد، أو L-A-E-M-A. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام بلمرة RAFT لكل من L-A-E-M-A و N-2-أمينو إيثيل ميثاكريلاميد، أو AEMA، و N-2-هيدروكسي إيثيل أكريلاميد، أو HEAA، لتخليق الجليكوبوليمر المقابل ذو التشتت المنخفض.

بعد ذلك، يتم تعديل البوليمر السكري على أحد أميناته الأولية عن طريق التفاعل مع carboxy fluorescein xito middle ester لإنتاج بوليمر سكري مُوسوم بالفلوريسين. وتتمثل الخطوة النهائية في ربط البوليمر السكري المُوسوم بالفلوريسين بخرزات agarose مغلفة باللكتين ذات خصوصية ربط معروفة بالكربوهيدرات. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لتحليل ارتباط البوليمرات السكرية بخرزات agarose، مما يؤكد أن البوليمر السكري يحتوي على الكربوهيدرات المستهدفة وأنه مُوسوم بعلامة فلورية.

تتمثل ميزة بلمرة RAF مقارنة بالطرق الحالية التي تستخدم بلمرة الجذور الحرة التقليدية في أن عملية RAF هي تقنية بلمرة متحكم بها تقلل من عدد السلاسل المشتقة من البادئ. ويؤدي ذلك إلى الحصول على بوليمرات ذات أوزان جزيئية محددة مسبقاً ونطاق توزيع متعدد التشتت ضيق للغاية. ويمكن تطبيق عمليات البلمرة هذه على خليط محدد من المونومرات لتحضير بوليمرات جليكوبوليمر فلورية محددة.

تمتلك هذه البوليمرات السكرية قدرات ربط محددة يمكن التحقق منها باستخدام خرزات مطلية باللكتين. ومن شأن التحضير الفعال للبوليمرات السكرية الفلورية أن يثبت قيمة كبيرة لأبحاث علم الأحياء السكري في المستقبل. للبدء، قم بإذابة جرامين من حمض اللاكتوبيونيك في 3 mL من الميثانول اللامائي.

بعد ذلك، أضف الإيثانول المطلق ببطء قطرة تلو الأخرى إلى المحلول حتى يبدأ في التعكر. استخدم المبخر الدوار لإزالة جميع المذيبات. كرر هذه العملية ثلاث مرات لإنتاج 1.94 grams من lacto bioo one five lactone بنسبة حصيلة بلغت 98%.

أضف محلولاً يتكون من 1 g من lactobiolactone في 3 mL من الميثانول إلى محلول من A EMA و MEHQ في 2 mL من الميثانول. بعد ذلك، أضف 1 mL من triethylamine وحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور 48 ساعة، أضف 20 mL من الماء منزوع الأيونات إلى الخليط وانقله إلى المبخر الدوار.

بخر المحلول حتى يجف تماماً. أذب الراسب في 20 milliliters من الماء منزوع الأيونات وضع المحلول على رأس عمود تبادل أنيوني مقاس 10 في 20 millimeter. ضع دورقاً يحتوي على 1 milligram من MEHQ أسفل المخرج وقم بشطف العمود في الدورق.

بعد سحب المحلول باستخدام مبخر دوار، قم بإذابة الراسب في 20 milliliters من الماء منزوع الأيونات وأضف حصصاً مقدارها واحد milligram من راتنج التبادل الأيوني. استمر في ذلك حتى تصبح نتيجة اختبار الجفاف سلبية، والذي يتم إجراؤه عن طريق سحب واحد microliter من المحلول ووضعه على لوح كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. رُش اللوح بمحلول 2%anhy في الإيثانول وسخنه عند 90 درجة Celsius لمدة دقيقة واحدة على لوح تسخين.

يتم الوصول إلى نقطة النهاية عندما لا يتكون أي لون أزرق. بعد ذلك، قم بترشيح المحلول عبر قمع زجاجي مسامي في أنبوبة اختبار. قم بتجميد المحلول عند درجة حرارة -80 °C ثم انقله إلى جهاز التجفيد ليتم تجفيفه بالتجميد.

أذِب الراسب في أقل كمية ممكنة من الميثانول ورسّب المنتج بإضافة الأسيتون اللامائي عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. اجمع L-A-E-M-A المترسب عن طريق الترشيح باستخدام قمع زجاجي مسامي. انقل القمع والراسب إلى مجفف تحت تفريغ هوائي للتجفيف، أولاً عند إضافة 0.5 grams تقريباً من جزيئات أكسيد الألومنيوم النانوية بحجم 150 mesh إلى 1 milliliter من HEAA بدرجة تجارية في أنبوب اختبار سعة 2 milliliter.

قم بمركزة الأنبوب عند 300 ×g لمدة 30 ثانية واستخدم الطبقة العليا كـ HEAA خالٍ من المثبط. أذب بعناية 32.8 mg من L-A-E-M-A و 1.7 mg من a EMA و 27.5 µL من HEAA الخالي من المثبط و 0.4 mL من الماء منزوع الأيونات، ثم انقل المحلول إلى أنبوب فلانك سعة 1 mL نظيف جيداً. بعد ذلك، أضف 50 µL من كاشف RAFT و 50 µL من كاشف البادئ إلى الأنبوب، واخلط المكونات عن طريق النقر بلطف على جانب الأنبوب بينما يكون الصمام مغلقاً. قم بتوصيل الأنبوب بخط تفريغ وجمّد المحتويات باستخدام حمام من الإيثانول والثلج الجاف.

بعد ذلك، قم بخفض ضغط الأنبوب ليكون في حدود 50 millitorr باستخدام مضخة، ثم أغلق الصمام. قم بإزالة حمام الثلج الجاف واترك المحتويات لتذوب. كرر دورة التجميد والتفريغ والإذابة مرتين إضافيتين بعناية.

افحص الأنبوب للتأكد من ذوبان المحتويات تماماً، واستخدم جهاز مزج العينات (vortex) برفق إذا لزم الأمر. قبل التثبيت، أخرج الأنبوب المغلق من خط التفريغ وضعه في كيس تفريغ بلاستيكي شفاف. قم بتفريغ الهواء من الكيس باستخدام مضخة يدوية بلاستيكية.

ثم ضع الكيس في حمام مائي مغطى عند 70 °C لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، أخرج الأنبوب من الكيس وانقل محتوياته إلى كيس دياليز بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 3,500 Daltons. ضع كيس الدياليز في دورق وقم بإجراء الدياليز مقابل لترين من الماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة.

انقل محتويات كيس الديلزة إلى أنبوب اختبار وضعه في مجمد عند درجة حرارة 80- °C. وبمجرد تجمده، انقله إلى جهاز التجفيف بالتجميد (lyophilizer) لإجراء التجفيف بالتجميد. وللحصول على بوليمر glyco PMA LA EMA الأبيض الهش، قم أولاً بتحضير محلول من 5 mg من PMA LA EMA في 0.9 mL من PBS.

بعد ذلك، أضف ببطء 0.6 milligrams من carboxy fluorescein cin, middle eter في 100 µL من dimethylformamide إلى المحلول المقلب بسرعة، ثم قم بتغطية الأنبوب الدقيق برقائق الألومنيوم، واتركه يقلب ببطء لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم انقل المحلول إلى كيس دياليز بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 3,500 Daltons. ضع الكيس في دورق وقم بإجراء عملية الدياليز مقابل لترين من الماء منزوع الأيونات لمدة 16 ساعة مع الحفاظ عليه محمياً من الضوء. انقل محتويات كيس الدياليز إلى أنبوب اختبار.

بعد تجميد المحلول عند درجة حرارة 80- درجة مئوية، يتم التجفيف بالتجميد. وللحصول على بوليمر السكري P-M-A-L-A-E-M-A المسمى بفلورسين أصفر هش، يتم تحديد متوسط الوزن الجزيئي العددي، ومتوسط الوزن الجزيئي الوزني، والتشتت للبوليمرات السكرية باستخدام نظام HPLC. أولاً، أضف 1.5 milliliters من PBS إلى معلق بحجم 50 microliter من حبيبات aro المغلفة بـ ery Krista galley lectin في أنبوب طرد مركزي.

ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 300 ×g لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، تخلص من الطافي وكرر عملية الغسل مرتين إضافيتين قبل إضافة 0.5 milliliters من PBS في النهاية. أضف محلولاً يحتوي على ثلاثة micrograms من PMA LA EMA المسمى بالفلوريسين في ستة µL من PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المغطى باللكتين.

استخدم P-M-A-G-A-E-M-A المسمى بالفلوريسين كعينة ضابطة سالبة. بعد ذلك، غلف الأنابيب بورق القصدير واتركها للحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بطرد مركزي للأنبوب لمدة دقيقة واحدة وتخلص من الراشح.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخرزات في 1.5 milliliters من محلول PBS طازج وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات. وأخيراً، أعد تعليق الخرزات في 0.2 milliliters من محلول PBS. انقل أربعة microliters من الخرزات المعلقة إلى بئر في شريحة مجهر الفلورة المناعية، ثم غطِّها بغطاء زجاجي وسجل النتائج.

صور للشريحة باستخدام مجهر فلوري مجهز بعدسة شيئية 10x ومرشح FITC وكاميرا. تم تحليل البوليمرات السكرية بواسطة كروماتوغرافيا نفاذ الهلام. تتميز البوليمرات التي تم تخليقها بدون استخدام raft بتشتت أعلى بكثير من تلك التي تم تحضيرها باستخدام raft.

عندما يتم وسم البوليمر السكري بصبغة الفلوريسين، يتغير مظهره الفيزيائي من اللون الأبيض إلى لون أصفر قوي يظهر تحت الأشعة فوق البنفسجية UV. ويظل محلول البوليمر غير الموّسم مظلماً، بينما يتوهج البوليمر الموّسم بالفلوريسين باللون الأخضر الساطع، مما يؤكد وجود الوسم. ولا يحدث الارتباط النوعي بالخرز المغلف بالليكتين إلا مع البوليمرات التي تحمل بقايا سكر معلقة، حيث يتوهج الخرز باللون الأخضر عند الارتباط، بينما يظل مظلماً عند معالجته ببوليمرات تفتقر إلى بقايا السكر المعلقة. وتتيح تقنية البلمرة القائمة على الطوافات هذه مرونة كبيرة في نوع البوليمرات السكرية التي يمكن تخليقها.

يمكن أيضاً تحقيق الوسم اللاحق للبوليمرات السكرية باستخدام مجموعة متنوعة من الكواشف الفلورية القادرة على التفاعل مع المجموعات الأمينية الأولية في بيئة مائية. ويمكن للباحثين في مجال علم البيولوجيا السكرية استخدام هذه التقنية للحصول بسهولة على بوليمرات سكرية محددة ومتعددة الاستخدامات. كما يمكن استخدام هذه البوليمرات السكرية كأدوات لاستكشاف خصوصيات الارتباط بالكربوهيدرات، مثل تلك التي لوحظت في الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من التليف الكيسي أو تلك المشاركة في أنواع عديدة من السرطانات البشرية.