إعداد سطحي والفعال للGlycopolymers نيون ثلاثي مكون عبر تسيطر عليها RAFT البلمرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو التوليف الذي يتم التحكم فيه جيدا لبوليمرات الجليكو الخطية الإحصائية الفلورية باستخدام تجزئة الإضافة القابلة للانعكاس أو نقل السلسلة أو بلمرة الطوافة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع مونومر الجليكو أولا اثنين من أكريلاميد إيثيل ميثيل اللاكتو الحيوي ، أو L-A-E-M-A. تتمثل الخطوة الثانية في استخدام بلمرة طوف من L-A-E-M-A-N اثنين من الأكريلاميد الإيثيل الأميني ، أو A EMA و N اثنين من هيدروكسي إيثيل أكريلاميد أو GAA لتصنيع بوليمر الجليكو منخفض التشتت المقابل.

بعد ذلك ، يتم تعديل بوليمر الجليكو على أحد الأمينات الأولية عن طريق التفاعل مع الكربوكسي فلورسين xito الإستر الأوسط لإنتاج بوليمر جليكو فلورسين. تتمثل الخطوة الأخيرة في ربط بوليمر الجليكو الأصلي الفلوريسئين بخرز الورد المطلي بالليكتين مع خصوصية ربط الكربوهيدرات المعروفة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لتحليل ارتباط بوليمرات الجليكو بالخرز الناشئة ، مما يؤكد أن بوليمر الجليكو يمتلك الكربوهيدرات ذات الأهمية ويتم تصنيفه بعلامة الفلورسنت.

تتمثل ميزة بلمرة سلاح الجو الملكي البريطاني على الطرق الحالية التي تستخدم بلمرة الجذور الحرة التقليدية في أن عملية الغضب هي تقنية بلمرة تحكم تقلل من عدد السلاسل المشتقة من البادئ. ينتج عن هذا بوليمرات ذات أوزان جزيئية محددة مسبقا ورف تشتت بولي ضيق جدا. يمكن تطبيق البلمرات على خليط محدد من المونومرات لتحضير بوليمرات جليكو فلورية محددة.

حددت بوليمرات الجليكو قدرات الربط التي يمكن التحقق منها باستخدام الخرز المطلي بالليكتين. يجب أن يثبت التحضير الفعال لبوليمرات الجليكو الفلورية أنه ذو قيمة كبيرة لأبحاث بيولوجيا الجليكو في المستقبل. للبدء ، قم بإذابة جرامين من حمض اللاكتو البيونيك في ثلاثة ملليلتر من الميثانول اللامائي

بعد ذلك ، أضف الإيثانول المطلق ببطء إلى المحلول حتى يصبح غائما. استخدم مبخر دوار لإزالة جميع المذيبات. كرر هذه العملية ثلاث مرات لإنتاج 1.94 جرام من اللاكتو بيو واحد خمسة لاكتون بنسبة 98٪ من المحصول.

أضف محلولا من جرام واحد من اللاكتو الحيوي في ثلاثة ملليلتر من الميثانول إلى محلول A EMA و MEHQ في ملليلترين من الميثانول. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من ثلاثي إيثيل أمين وحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة. بعد 48 ساعة ، أضف 20 مل من الماء منزوع الأيونات إلى الخليط وانقله إلى مبخر دوار.

يتبخر حتى يجف تماما. قم بإذابة البقايا في 20 مل من الماء منزوع الأيونات وقم بتطبيق المحلول على الجزء العلوي من عمود تبادل الأنيون 10 × 20 ملم. ضع كوبا يحتوي على ملليغرام واحد من MEHQ أسفل المخرج وقم بإخراج العمود في الدورق

بعد سحب المحلول في مبخر دوار ، قم بإذابة البقايا في 20 مل من الماء منزوع الأيونات وأضف ملليغراما واحدا من راتنج التبادل الأيوني. حتى يصبح اختبار صنبور المياه سلبيا ، يتم إجراؤه في اختبارات صنبور المياه عن طريق إزالة ميكرولتر واحد من المحلول وتطبيقه على لوحة كروماتوغرافيا رقيقة الطبقة. رش اللوحة بمحلول 2٪ anhy في محلول الإيثانول وتسخينها على حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة على طبق ساخن.

تم الوصول إلى نقطة النهاية عندما لا يتشكل لون أزرق. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول من خلال قمع زجاجي ممزق في أنبوب اختبار. قم بتجميد المحلول عند سالب 80 درجة مئوية ثم انقله إلى مجفف التجميد

قم بإذابة البقايا في الحد الأدنى من الميثانول وترسيب المنتج بإضافة 20 درجة مئوية تحت الصفر والأسيتون اللامائي اجمع L-A-E-M-A المترسب عن طريق الترشيح من خلال قمع زجاجي متجكد. انقل القمع واترسبه إلى فراغ مجفف للتجفيف أولا عند 0.5 جرام من حوالي 150 شبكة من الجسيمات النانوية لأكسيد الألومنيوم إلى مليلتر واحد من HEAA من الدرجة التجارية في أنبوب اختبار ملليلتر.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة 30 ثانية واستخدم الطبقة العليا كمثبطات خالية من HEAA قم بإذابة 32.8 ملليغرام من L-A-E-M-A و 1.7 ملليغرام من EMA و 27.5 ميكرولتر من HEAA الخالي من المثبطات و 0.4 مل من الماء منزوع الأيونات ونقل المحلول إلى أنبوب جانبي نظيف جيدا سعة مليلتر واحد. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من كاشف الطوافة و 50 ميكرولترا من كاشف البادئ إلى الأنبوب واخلطه عن طريق النقر برفق على جانب الأنبوب مع إغلاق الصمام. قم بتوصيل الأنبوب بخط تفريغ وتجميد المحتويات باستخدام حمام الإيثانول الثلجي الجاف.

ثم قم بتقليل ضغط الأنبوب ليميل إلى 50 ملليتور بمضخة وأغلق الصمام. قم بإزالة الحمام الجليدي الجاف واترك المحتويات تذوب. كرر دورة التجميد والتفريغ والذوبان مرتين بعناية أخرى.

افحص الأنبوب للتأكد من ذوبان المحتويات تماما ودوامة برفق إذا لزم الأمر. قبل الجلوس ، قم بإزالة الأنبوب المغلق من خط التفريغ وضعه في كيس مفرغ بلاستيكي شفاف. قم بإخلاء الهواء من الكيس بمضخة يدوية بلاستيكية.

ثم ضع الكيس في حمام مائي مغطى على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من الكيس ونقل محتوياته إلى كيس غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي 3،500 دالتون. ضع كيس غسيل الكلى في دورق وغسيل الكلى مقابل لترين من الماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة.

انقل محتويات كيس غسيل الكلى إلى أنبوب اختبار وضعه في الفريزر على درجة حرارة سالب 80 درجة مئوية. بمجرد التجميد ، انقله إلى مجفف التجفيف في التجميد. للحصول على بوليمر الجليكو الأبيض الرقيق PMA LA EMA أولا ، قم بإعداد محلول مكون من خمسة ملليغرام من PMA LA EMA في 0.9 مل من PBS.

بعد ذلك ، أضف ببطء 0.6 ملليغرام من الكربوكسي فلورسين سين ، eter الأوسط في 100 ، ميكرولتر من ثنائي ميثيل فورماميد إلى المحلول سريع التقليب ، والأنبوب الصغير والرقائق ، وحركها ببطء لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وانقل المحلول إلى كيس غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 3 ، 500 دالتون. ضع الكيس في دورق وقم بغسيل الكلى مقابل لترين من الماء منزوع الأيونات لمدة 16 ساعة مع إبقائه محميا من الضوء. انقل محتويات كيس غسيل الكلى إلى أنبوب اختبار.

بعد تجميد المحلول عند سالب 80 درجة مئوية ، قم بتجميدها حتى تجفيف. للحصول على الفلوريس الأصفر الرقيق المسمى P-M-A-L-A-E-M-A ، بوليمر جليكو ، حدد متوسط الوزن الجزيئي ، والوزن ، ومتوسط الوزن الجزيئي ، وتشتت بوليمرات الجليكو باستخدام نظام HPLC. أولا عند 1.5 مل من PBS إلى تعليق 50 ميكرولتر من خرز أرو المطلي بالليكتين في أنبوب طرد مركزي.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وكرر الغسيل مرتين أخريين قبل إضافة 0.5 مل من PBS في النهاية. أضف محلولا من ثلاثة ميكروغرامات من الفلورسين المسمى PMA LA EMA في ستة ميكرولترات من PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المطلي بالليكتين.

استخدم الفلورسين المسمى P-M-A-G-A-E-M-A كعنصر تحكم سلبي. بعد ذلك ، لف الأنابيب بورق القصدير واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية.

ثم ريوس ، قم بتعليق الخرزات في 1.5 مل من PBS الطازج وكرر الغسيل ثلاث مرات. أخيرا ، قم بتعليق الخرزات في 0.2 مل من PBS انقل أربعة ميكرولترات من الخرزات العالقة إلى بئر من المجهر المناعي. انزلق وقم بتغطيته بسجل انزلاق غطاء زجاجي.

صور للشريحة باستخدام مجهر فلوري مزود بفلتر FITC موضوعي 10 × وكاميرا. تم تحليل بوليمرات الجليكو بواسطة كروماتوغرافيا نفاذية الجل. البوليمرات التي يتم تصنيعها دون استخدام الطوافة لها تشتت أعلى بكثير من تلك المصنوعة باستخدام الطوافة.

عند تسميته بالفلورسين ، يتغير المظهر المادي لبوليمر الجليكو من الأبيض إلى اللون الأصفر القوي الموضح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يظل محلول البوليمر غير المسمى داكنا بينما يضيء البوليمر المسمى بالفلورسين اللون الأخضر الفاتح الذي يؤكد وجود ارتباط خاص بالخرز المطلي بالليكتين يحدث فقط مع البوليمرات التي تحمل بقايا السكر المعلقة ، تتوهج باللون الأخضر عند ربطها ، بينما تظل داكنة عند معالجتها بالبوليمرات التي تفتقر إلى بقايا السكر المعلقة. تسمح تقنية البلمرة القائمة على الطوافة بمرونة كبيرة في نوع بوليمرات الجليكو التي يمكن تصنيعها.

يمكن أيضا تحقيق وضع العلامات اللاحقة لبوليمرات الجليكو باستخدام مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكواشف الفلورية القادرة على التفاعل بالوسائل الأولية في بيئة مائية. يمكن للباحثين في مجال بيولوجيا الجليكو استخدام هذه التقنية للحصول بسهولة على بوليمرات جليكو متعددة الاستخدامات ومحددة. يمكن استخدام بوليمرات الجليكو هذه كأدوات لاستكشاف خصائص ربط الكربوهيدرات ، مثل تلك التي لوحظت في المسار التنفسي للمرضى الذين يعانون من التليف الكيسي أو أولئك المتورطين في العديد من أنواع السرطانات البشرية.