Name: الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي في المختبر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: تعلم تقنية كمّية جديدة لقياس التصاق الخلايا البطانية في المختبر باستخدام خلايا الشرايين التاجية البشرية. تتيح هذه الطريقة للباحثين تحديد نسبة الخلايا اللاصقة بدقة عالية بعد المعالجات المختلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن ممتنون جدا لسايمون بوفلر لدعمه الكامل وللصحة العامة في إنجلترا لدعم البنية التحتية. تم دعم هذا العمل من قبل الصحة العامة في إنجلترا من خلال منحة المعهد الوطني للبحوث الصحية (NIHR). هذا التقرير هو عمل بتكليف من المؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان. الآراء المعبر عنها في هذا المنشور هي آراء المؤلفين وليست بالضرورة آراء NHS أو NIHR أو وزارة الصحة. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

1. إعداد coverslips الزجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم 12 ملم coverslips الزجاج قطر التي نقع عليها في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة على الأقل مع الإثارة في بعض الأحيان لضمان التعرض الكلي لجميع coverslips إلى الإيثانول. صب coverslips الزجاج والايثانول في طبق خلية ثقافة عقيمة (إما 6 سم أو 10 سم القطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من معقمة غرامة 5B ملقط، والتقاط ووضع كل ساترة الزجاج الفردية في بئر من 24 لوحة العنقودية بشكل جيد. الحرص على ضمان لل coverslips لا تلامس جوانب البئر وما يقرب من في منتصف البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحة المغطاة الامم المتحدة 24 عنقودية بشكل جيد مع coverslips الزجاج لتجف في مجلس الوزراء التدفق. وهذا يستغرق حوالي 10 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الفترة، وإعداد مزيج الطلاء عن طريق تمييع 10 ملغ / مل فبرونيكتين الإنسان في المتوازن محلول الملح هانك (HBSS) إلى 0.1 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون لل coverslips الجافة، ماصة 100 ميكرولتر من محلول طلاء على كل الزجاج المشتركverslip ذلك الحل لا يغطي سوى الزجاج دون تجمع نحو الخارج من البئر. وضع لوحة غطت 24 عنقودية جيدا في حاضنة الثقافة خلية لمدة ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الاستعمال، وإزالة حل طلاء. يمكن نقل الحل طلاء نفسه إلى أنبوب معقم واستخدام ما يصل الى ثلاث مرات مع عدم فقدان مرئية من الفعالية. </li></ol> 2. إعداد البطانية أحادي الطبقة خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة الإنسانية الشريان البطانية (EC) في المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من وسائل الإعلام والثقافة، وشطف EC أحادي الطبقة مع 10 مل HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة HBSS وإضافة 2 مل 0.5٪ التربسين، 0.2٪ محلول EDTA. في احتضان RT لمدة 5 دقائق تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما EC يمكن إقصاؤه من خلال الصنبور إلى جانب القارورة، إضافة 5 مل من فول الصويا مثبط التربسين ومع ماصة بخ سطح القارورة لزيادة إزاحة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في أنبوبفي 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من طاف و resuspend بيليه EC في 5 مل من وسائل الإعلام. عد الخلايا مع haemocytometer وضبط تركيز الخلية إلى 50000 EC لكل مل من EC سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 مل من تعليق خلية في كل بئر من 24 لوحة جيدا تحتوي على coverslips الزجاج المطلي. احتضان خلايا O / N في ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا جاهزة للاستخدام في التجارب عندما يتم تشكيل أحادي الطبقة متموجة، في غضون 3 أيام. </li></ol> 3. إعداد وحيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل HL-60 الخلايا التي يتم تربيتها في RPMI تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، والثقافة التعليق في أنبوب 15ML. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل وسائل الإعلام وضبط تركيز الخلية مع وسائل الإعلام إلى 2 مليون خلية / مل. إذا كان المطلوب وضع العلامات مضان من HL-60، resuspend الخلايا في RPMI دون المصل والعلاقات العامةoceed كما هو موضح في قسم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من HL-60 تعليق خلية في كل بئر من لوحة 24 عنقودية كذلك تحتوي EC أحادي الطبقة واحتضان لوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة محددة من الزمن اختار ما بين 1 و 3 ساعة. ويلاحظ فارق كبير بين 1 ساعة و 3 ساعة الوقت نقطة، حيث بلغ التشبع ملزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير للخلية غسل / حصاد: ملء أنبوب 120 مل مع 100 مل من HBSS. الاستغناء 1 مل من الفورمالين في كل بئر من 24 لوحة جديدة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، واستخدام زوج من الملقط حادة والتقاط ساترة الزجاج من البئر وعقد ساترة رأسي والداب حافة ساترة على قطعة من النسيج على مقاعد البدلاء لمدة 3 ثانية، مع الحرص على عدم لمس السطح المغطاة خلية من ساترة مع الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ساترة بحزم مع زوج من ملقط، دونك ساترة ويخرجون من HBSS خمس مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد دونك الخامسفي HBSS، الداب حافة ساترة على الأنسجة لمدة 3 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الإجراءات التغميس واللمس هو موضح في 3.6 و 3.7، مما يجعل ما مجموعه ثلاث مجموعات من 5 يغمس تليها لمسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ساترة إلى تحتوي أيضا 10٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا في RT. ساترة جاهزة للتعداد، للتخزين طويل الأجل أو أن تخضع لإجراءات أخرى هو موضح أدناه. </li></ol> 4. وسمها HL-60 الخلايا مع المقتفي الخليوي (اختياري) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد ونقل كمية مناسبة من HL-60 الخلايا (على سبيل المثال، 10 مليون دولار) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الطرد المركزي HL-60 الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلية resuspend في تعقب خلية في RPMI وسائل الإعلام دون المصل في تركيز 1 مليون خلية / مل. احتضان الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. بيليه الخلية resuspend في وسائل الإعلام إلى التركيز من 2000000 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من المسمى تعقب خلية HL-60 إلى تحتوي كل منها على جانب الخلايا البطانية التي تزرع على الزجاج ساترة. تواصل في 3.3. </li></ol> 5. تعداد الخلايا البطانية لاصق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل coverslips على شرائح المجهر مع دابي مكافحة وصمة عار لتحديد الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب مع الهدف 4X أو 10X، والحصول على صور العديد من المجالات (على سبيل المثال، 5 الحقول) والاعتماد على أعلى عدد من وحيدات التي تجمع على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع (يجب أن يكون هذا عادة 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مرتين هذا العدد كما عتبة حيدات على خلية البطانية أن أن يعرف بأنه كتلة. إذا لزم الأمر، معيارا مختلفا يمكن استخدامها لتحديد كتلة تبعا لطبيعة التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الكتل وعدد من الخلايا البطانية في هذا المجال. تقسيم الأولى قبل الأخير للحصول على نسبة الخلايا البطانية لاصقة. أحرز هدفاالعديد من المجالات للحصول على انحراف متوسط ​​و المستوى من التهم الموجهة إليه. </li></ol> 6. Counterstaining مع الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في 10٪ من الفورمالين لمدة 15 دقيقة في RT، تخضع لل coverslips إلى المناعي باستخدام الإجراء العادي 10 و الأجسام المضادة في الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية. </li></ol> 7. Counterstaining للالمرتبط اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز آخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في الفورمالين لمدة 15 دقيقة، وصمة عار للنشاط بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة كما هو موضح في التعليمات التي تصاحب عدة تلطيخ. إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية. </li></ol>

<ol><li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li>
<li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells%3A+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li>
<li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li>
<li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin%2C+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li>
<li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تم استخدام فحص الوحيدات التصاق المذكورة أعلاه بنجاح في التجارب تهدف إلى دراسة التأثيرات البيولوجية للإشعاع المؤين على الطبقات الوحيدة البطانية 10. على الرغم من أن هذا ليس هو الأسلوب الوحيد المتاح لتقييم الإلتصاق من أحادي الطبقة البطانية، وهو الأسلوب الوحيد الذي يسمح الكمي لنسبة أو نسبة الخلايا البطانية في أحادي الطبقة التي هي لاصقة. هذا تمييز مهم كتغيير الكمي عالميا في التصاق حيدات، كما تم قياسها عن طريق وسائل أخرى يمكن أن تعزى إما إلى الارتفاع العام في الإلتصاق جميع خلايا أحادي الطبقة البطانية أو إلى زيادة الإلتصاق من السكان الفرعي من الخلايا البطانية ضمن أحادي الطبقة، كما هو موضح في المثال أعلاه. ويتمثل قيمة وجود هذه المعلومات من خلال حقيقة أن القدرة لقياس نسبة الخلايا البطانية التي عرضت تعزيز الإلتصاق بعد التشعيع أدى إلى إيناسوكانت النتيجة قادر أن هذا التأثير لا يعود إلى طفرة جينية من الجين على نحو خاص والنسبة المئوية للخلايا التي كانت لاصقة جدا فوق (أكثر من 1000 مرة) ما هو متوقع من طفرة عشوائية من الجينات التي كتبها X-الإشعاع عند هذه الجرعة . العامل الذي يسمح استنساخ جيدة من النتائج هو نظام الغسيل. كما ينطوي على إجراء الغسيل غمر ساترة الزجاج في غسل العازلة تليها اللمس على الأنسجة، ويتم تجنب التقلبات في الاضطرابات العازلة التي تنشأ حتما من الطريقة القديمة المتمثلة في pipetting لمن غسل العازلة في بئر. في الواقع كان مراقبة التقلبات المفرطة بين مكررات تم الحصول عليها باستخدام أسلوب pipetting لأن أجبرتنا على وضع إجراءات الغسل أن إزالة عنصر التباين من خطوة الغسيل. باعتراف الجميع، والقيود المفروضة على هذا الاختبار تكمن في الحاجة إلى إجراء العد اليدوي لمجموعات الوحيدات، والتي لا نبعد التمديد يسمح لها أن تتكيف لتحليل إنتاجية عالية. ثانيا، قرار بشأن كيفية تشكل العديد من وحيدات مجموعة أن تحدد شبه تعسفي ويمكن ضبط مستوى عال جدا ويؤدي إلى استبعاد بعض الكتل حقيقية. ويمكن أيضا لعدم وجود قوة القص في هذه الطريقة أن ينظر إليه باعتباره القيد في التجارب التي يسببها الإلتصاق معززة بشكل صارخ من الخلايا البطانية (على سبيل المثال، + TNFα). في حالات أخرى ومع ذلك، فإن عدم وجود قوة القص هي ميزة لأنها تتيح للكشف عن زيادة أقل مبالغ فيه من الإلتصاق. زيادة متواضعة في الوحيدات الإلتصاق يمكن أن تكون ذات أهمية خاصة وذات الصلة. في الجسم الحي، لن (في وقت تجريبي نموذجي) من المتوقع أن نعلق بأعداد كبيرة إلى الخلايا البطانية مع زيادة متواضعة في الإلتصاق، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قوة القص وحيدات. في الوقت ومع ذلك، بعض وحيدات على الارجح، وهذا هو الأرجح لتمثيل البيئة من التهاب مزمن. كما،غياب قوة القص يمكن أن يكون ميزة، حيث أنه يوفر الفرصة لزيادة طفيفة في الإلتصاق الخلايا البطانية ان يعلن في الأطر الزمنية التجريبية التي عادة ما تكون قصيرة، وربما عابرة جدا للسماح زيادة متواضعة في الإلتصاق التي يتعين مراعاتها تحت إجهاد القص. القدرة على إخضاع الخلايا بعد هذا الاختبار إلى تحليلات أخرى مثل فحص الشيخوخة والمناعي تلطيخ يزيد من فائدة هذه الطريقة لأنها تتيح للجمعية الإلتصاق من الخلايا البطانية محددة لخاصة البروتينات الخلوية أو الدول الخلوية كما هو موضح أعلاه، وهي الميزة التي غير متوفر مع فحوصات التصاق القديمة. وقد استخدم هذا الأسلوب مع الخلايا التاجية الإنسان خلد est2 البطانية ونتائج مماثلة تم الحصول عليها أيضا مع الخلايا التاجية الإنسان الأساسية البطانية 10، مما يدل على أنه ليس خاصا فقط خط خلية معينة. أيضا، واللغطption هذه الطريقة من معايرة الإلتصاق من الخلايا البطانية لا يحول دون تعريض الخلايا نفسها لفحص التصاق القياسية التي تقيس مضان من immunocytes المسمى. معا، ويوضح هذا التقرير أن هذه الطريقة هي متعددة وشامل ويوفر المزيد من المعلومات من التصاق الفحص القياسية.

<html> تسلل الخلايا المناعية مثل وحيدات عبر طبقة الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية هو خطوة هامة في عملية الالتهاب 1. وهذا يسمح للصاروخ موجه من الخلايا المناعية (immunocytes) إلى موقع الإصابة. في حالات ومواقع أخرى مثل الشريان التاجي والشريان السباتي، يمكن التسلل من وحيدات من خلال طبقة بطانة يؤدي إلى إقامة غير مرغوبة على المدى الطويل من هذه الخلايا في جدار الشريان، مما قد يؤدي إلى تكوين لويحات 2. في جميع حالات تسلل خلية مناعية، فإن الخطوة الأولى تنطوي على تفعيل الخلايا البطانية في منطقة مترجم من الأوعية الدموية. يتم تنشيط الخلايا البطانية التي كتبها السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل TNF-α و IL-6 لزيادة التعبير عن بروتينات سطح الخلية مثل VCAM، ICAM وE-selectin التي تسهل التوظيف والحجز على immunocytes على سطح الخلايا البطانية 3- 6. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; في البداية، تم إجراء قياس التصاق الخلايا البطانية بها عد حيدات أن تلتزم البطانية أحادي الطبقة 7. وأدت القيود المفروضة على هذه الطريقة من حيث الدقة في استخدام الخلايا اللمفاوية المسمى الراديو أو الوحيدات، تليها الكمي للمواد المشعة والتي تتطابق مع الخلايا الليمفاوية أو وحيدات التصاق 4. هذه الطريقة حلت محلها في نهاية المطاف من خلال طريقة القائم على مضان، حيث وصفت immunocytes في المصالح مع مضان صبغ وتعرض لنفس الإجراء على النحو الوارد أعلاه مع والفرق بينهما أن مضان بدلا من النشاط الإشعاعي يتم قياس 8. في الوقت الحاضر هذا الأسلوب قد برز بوصفه الأكثر ملاءمة ويباع في شكل مجموعة من قبل العديد من الموردين التجارية. في حين أن هذا الفحص يمكن قياس المستويات النسبية للالإلتصاق بين الضوابط والعينات التجريبية، فإنه لا يكشف ما إذا كان هناك تغيير في مضان يرجع ذلك إلى تغيير موحد في الإلتصاق عبر البريد كاملالسكان الخلية ndothelial أو إذا كان التغيير هو بسبب وجود اختلاف في الإلتصاق بين السكان الفرعي من الخلايا. ومن الواضح أيضا أن التشدد في غسل تمارس تأثير عميق على النتيجة، والأهم من ذلك، فإن توحيد الشطف قبالة حيدات غير منضم بين مختلف الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تؤثر بشكل كبير على التقارب في نتائج مكررات واستنساخ النتائج بين العينات . وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام عدة أنظمة التي تضخ حيدات في وسائل الإعلام عبر أحادي الطبقة البطانية خلية لمعالجة هذه المشكلة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النظم تدفق أيضا ألخص تأثير قوة القص على الخلايا البطانية. في حين أن مزايا هذه الأنظمة واضحة وجذابة للغاية، ومن المهم أيضا أن ندرك أنه في حين أن الإلتصاق الخلايا البطانية يمكن زيادتها إلى حد كبير، كما هو الحال في التهاب حاد، بسبب عوامل مثل TNFα، وبعض المنشطات الأخرى، مثل الإشعاع المؤين 10 انتزاع يتغير رلم يتم الكشف عن قبعة بسهولة داخل الإطارات في المختبر الوقت التجريبية من قبل هذه الأنظمة الصارمة جدا. في حين تغييرات في اللحظة هذه من الإلتصاق الخلايا البطانية وغاب بسهولة أو رفضت في المختبر، فإنه ليس بالضرورة حميدة في الجسم الحي، حيث مثل هذه التغييرات الصغيرة في غضون فترة زمنية الحياة، الذي هو سمة من التهاب مزمن، يمكن أن تمارس نتائج كبيرة جدا. وبالتالي وسيلة قوية، ولكن حساسية، ومحددة لكشف وقياس هناك حاجة الإلتصاق الخلايا البطانية. هنا، ونحن التقرير وسيلة لقياس الإلتصاق من الخلايا البطانية مباشرة. هذه الطريقة لا تعتمد على قياس مضان كمؤشر مركب غير مباشر من الإلتصاق الخلايا البطانية. أنه يكشف ما إذا كانت التغييرات في الإلتصاق ومن المقرر أن التغيير موحد في جميع الخلايا أو تقتصر على سكان الفرعي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح شارك في تلطيخ الخلايا البطانية مع علامات مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز، بقاء الخلية مارسكير، Calcien AM والأجسام المضادة ضد سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا، مما يتيح للجمعية الخلايا البطانية لاصقة الفردية لبعض الدول خلية أو التعبير عن بروتينات معينة.

<table><tbody><tr><td>محلول ملحي مخزن من Hepes (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>أغطية زجاجية مستديرة بقطر 12 مم</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>لوحة عنقودية 24 بئرا</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr> تطبيقات <tr><td>خلية وسائط Meso-Endo</td><td></td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>فول الصويا مثبط التربسين</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>مصل العجل الجنيني</td><td>Life</td><td>Technologies 10500064</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة فحص Beta glasctosidase&nbsp; &nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

واحدة من العمليات الأساسية للالتهاب غير تسلل الخلايا المناعية من التجويف من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة بها. يحدث هذا عندما الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية، تصبح لاصقة لتعميم الخلايا المناعية مثل وحيدات. وحتى تم ذلك في المختبر قياس هذا الإلتصاق الآن عن طريق قياس عدد من وحيدات التي تلتزم طبقة بطانة إما العد المباشر أو عن طريق قياس غير مباشر لمضان من حيدات ملتصقة. وفي حين أن هذه القياسات لا تشير إلى متوسط ​​الإلتصاق من السكان الخلايا البطانية، ومرتبك من قبل عدد من العوامل، مثل عدد الخلايا، وعدم الكشف عن نسبة الخلايا البطانية التي هي لاصقة في الواقع. نحن هنا وصف وشرح الطريقة التي تسمح للتعداد خلايا لاصقة داخل الكتلة السكانية اختبار أحادي الطبقة البطانية. تزرع الخلايا البطانية على coverslips الزجاج ويلي المرجوةوتحدى العلاج مع حيدات (التي قد يتم fluorescently المسمى). بعد الحضانة، وإجراء الشطف، التي تنطوي على جولات متعددة من الغمر والصرف الصحي، يتم إصلاح الخلايا. يتم تحديد بسهولة الخلايا البطانية لاصقة، والتي تحيط بها وحيدات وتعداد، وهو ما يعطي مؤشر التصاق أن يكشف عن النسبة الفعلية من الخلايا البطانية في أوساط السكان التي هي لاصقة.

هذا الأسلوب يسمح للكشف عن الخلايا البطانية لاصقة الفردية بين السكان. على سبيل المثال، في حين أحادي الطبقة من الخلايا البطانية-المشع الامم المتحدة احتفظت بضع متفرقة HL-60 حيدات التالية الحضانة والغسل، وأحادي الطبقة البطانية في 7 أيام بعد 10Gy التشعيع قبل الحضانة مع حيدات كان لا بد حيدات في مجموعات حول الخلايا البطانية الفردية ( الشكل 1). على الرغم من أن هذه الظاهرة يمكن ملاحظتها بسهولة في إطار المرحلة النقيض المجهر، المجهر مضان يكشف عن صورة أكثر وضوحا من مجموعات الوحيدات. بعد إجراء الفحص التصاق وصفها، فمن الممكن للشروع في تلطيخ الخلايا لغشاء، حشوية أو الطاقة النووية (الشكل 2) البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المناسبة مع أساليب المناعي القياسية. وعلاوة على ذلك، فحص القائم على انزيم مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز (الشكل 3) يمكن أيضا أن تكون المؤسسة العامةrformed. لأن كل كتلة الوحيدات يتوافق مع خلية البطانية الفردية، وتعداد مجموعات تكشف عن العدد الفعلي للخلايا البطانية لاصقة داخل أحادي الطبقة (الشكل 4)، وبالتالي فإن النسبة المئوية للخلايا البطانية لاصقة داخل السكان (الجدول 1، الشكل 6) . هذه هي الطريقة الوحيدة حتى الآن التي تسمح بمثل هذه الكمي من الإلتصاق الخلايا البطانية. من الجدير بالذكر أن الخلايا البطانية التي استخدمت في التجارب هنا، تحول دون الاتصال ولا تزيد في عدد بعد تحقيق التقاء. هذا يلغي التعقيد المحتمل الذي تشكله زيادة عدد الخلايا البطانية في نقطة زمنية لاحقة. إذا رغبت في ذلك، وحيدات تعلق على الطبقات الوحيدة البطانية يمكن طردت بنسبة 0.5٪ محلول التربسين 0.2٪ EDTA (بدلا من التثبيت في 3.9) ومضان على قياس باستخدام قارئ لوحة، كما هو الحال في الطرق المعاصرة (الشكل 5). </P&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> الشكل 1. التصاق حيدات على أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع، وحيدات التقيد شكل خلايا مستقلة بطريقة متفرقة وعشوائية (لوحات اليسار) وفي مجموعات على الخلايا البطانية الفردية لل7 أيام بعد 10 غراي المشع أحادي الطبقة (لوحات اليمين). لوحات الدنيا هي صور مضان من لوحات العليا، مؤكدا أن خلايا صغيرة ومشرقة كروية مرئية تحت النقيض من المرحلة هي في الواقع حيدات التي وصفت قبل مع الخلية المقتفي الأخضر. وأشار بعض الكتل الوحيدات التي كتبها السهام البيضاء. واتخذت صورة باستخدام الهدف 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html><img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> الشكل 2. تلطيخ الخلايا البطانية للبروتينات بعد التصاق الفحص. بعد الانتهاء من فحص التصاق وصفها، وتعرض الخلايا على coverslips الزجاج لالمناعي للكشف عن (A) بروتين الغشاء (CD44)، ب) بروتين حشوية (تويولين) أو ج) البروتين النووي (γ-H2AX). لوحات اليسار من (A) و (B) (شهدت مع الهدف 20X) عرض حيدات وصفت مسبقا مع تعقب خلية الأخضر وصورة مماثلة على لوحات اليمين تكشف CD44 والأنابيب الدقيقة (أحمر) ونوى دابي الملون (الأزرق). السهام البيضاء في (C) نقطة لالمشع نوى الخلايا البطانية التي كانت ملطخة أجسام مضادة ضد γ-H2AX. وتتميز نواة الوحيدات التي هي ملطخة أكثر إشراقا الأزرق التي كتبها دابي بسهولة من بيضاوية الشكل نوى الخلايا البطانية. وقد أخذت صور مع الهدف 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> الرقم 3. المرتبطة اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز تلطيخ الخلايا البطانية بعد التصاق الفحص، وتعرض خلايا coverslips على لتلطيخ للالمرتبط الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز الذي يسبب الجسيمات الحالة خلايا هرمة لتحويل الأزرق، كما هو واضح في الخلية البطانية التي بشكل انتقائي ملزمة من قبل العديد من وحيدات، والتي يتم تحديدها بسهولة نظرا لصغر حجمها وشكلها كروي. الصورة المرئية من خلال الهدف 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; الرقم 4. تعداد مجموعات الوحيدات على الخلايا البطانية الفردية. بعد التصاق الفحص، واتخذت صورة من الخلايا من العديد من المواقف المختلفة ومجموعات الوحيدات التي تم تحديدها ودائري (باللون الأخضر). تم تعريف الكتلة باعتبارها التكتل من 10 أو أكثر من وحيدات الخلية على البطانية. احصي عدد الكتل الوحيدات وعدد 12 أيام الخلايا البطانية بعد المشع (منقط باللون الأحمر) في الصورة ونسبة الخلايا البطانية ملتصقة تحسب كما هو مبين في الجدول 1. الصورة مأخوذة من خلال الهدف 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> الرقم 5. الكمي لمضان من حيدات ملتصقة. بعد adhe<html> سيون الفحص، تم trypsinised الخلايا على coverslips الزجاج ومضان من حيدات صفت مسبقا مع CellTracker الخضراء وقد تم قياس، وذلك باستخدام قارئ لوحة مضان، كمؤشر غير مباشر من لزوجة أحادي الطبقة البطانية. وقد تم الحصول على نتائج هذه القياسات في الأيام جاء بعد التشعيع وضفروا على الرسم البياني أعلاه. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> الرقم 6. تمثيل عشرات التصاق مقايسة من الجدول 1. وسجل لاصق الخلايا البطانية في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في الشكل (4) والنتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، 8-10 في المئة من المشع أصبحت الخلايا البطانية لاصقة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; نسبة من مادة لاصقة الخلايا البطانية </td></tr><tr><td></td><td> القرص 1 </td><td> القرص 2 </td><td> القرص 3 </td></tr><tr><td> المجال 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> الميدان (2) </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> الحقل 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> الحقل 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> المجال 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> متوسط </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. التصاق عشرات الفحص. وسجل الخلايا البطانية لاصقة في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في Figure 4 ونتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، أصبحت 8 الى 10 في المئة من الخلايا البطانية المشع لاصقة.

نبلغ عن طريقة في المختبر تسمح بتحديد العدد الفعلي للخلايا اللاصقة داخل طبقة أحادية للخلية البطانية.

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مدى التصاق الخلايا البطانية في المختبر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير شرائح غطاء زجاجية مطلية بالفبرونيكتين في طبق مجمّع من 24 بئراً. بعد ذلك، تُوضع خلايا بطانية من الشريان التاجي البشري على الشرائح الزجاجية وتُترك لتتحضن حتى تتشكل طبقة أحادية متصلة من الخلايا البطانية.بعد إعطاء العلاج المطلوب للخلايا البطانية، تُضاف المونوسيتات الموصومة فلورياً إلى أغطية الشرائح الزجاجية وتُحضن مع الطبقة الأحادية من الخلايا البطانية. وتتمثل الخطوة النهائية في إزالة المونوسيتات غير المرتبطة من الطبقة البطانية الأحادية من خلال إجراء دقيق لغمس وغسل أغطية الشرائح. وفي النهاية، تتيح هذه الطريقة قياس النسبة المئوية لمجتمع الخلايا البطانية الذي يكون لاصقاً بعد علاج معين.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تقيس العدد أو النسبة المئوية الفعلية للخلايا البطانية الملتصقة، بدلاً من قياس اللزوجة العامة لطبقة أحادية من الخلايا البطانية كما تفعل جميع الطرق الحالية. لقد تولدت لدينا الفكرة لهذا الأسلوب عندما حاولنا قياس مؤشرات التصاق الخلايا البطانية (ADIs) باستخدام الطرق المتاحة حالياً، وواجهنا تفاوتاً كبيراً وغير مقبول في النتائج بسبب التحديات التقنية المتأصلة في تلك الطرق. يتم تعقيم شرائح غطاء زجاجية مستديرة بقطر 12 مليمتر عن طريق نقعها في 70%ethanol لمدة 10 دقائق على الأقل مع الرج من حين لآخر لضمان تعرض جميع شرائح الغطاء للإيثانول بشكل كامل.بعد ذلك، يتم نقل جميع شرائح التغطية الزجاجية والإيثانول إلى طبق زراعة خلايا معقم باستخدام زوج من ملاقط 5B الدقيقة والمعقمة. يتم التقاط كل شريحة تغطية زجاجية على حدة ووضعها في عين من لوحة زراعة مكونة من 24 عينًا. يجب الحرص على ضمان عدم ملامسة شرائح التغطية لجدران العين ووضعها في منتصفها تقريبًا، ثم تُترك لوحة الزراعة ذات الـ 24 عينًا والتي تحتوي على شرائح التغطية الزجاجية المكشوفة لتجف داخل كابينة التدفق الصفحي.تستغرق هذه العملية حوالي 10 دقائق. وعندما تجف شرائح الغطاء، أضع 100 µL من محلول الطلاء على كل شريحة غطاء زجاجية بحيث يغطي المحلول الزجاج فقط دون أن ينسحب إلى الحواف الخارجية للبئر. يتم وضع لوحة التجمع ذات الـ 24 بئرًا المغطاة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة على الأقل.يتم استزراع الخلايا البطانية للشرايين التاجية البشرية في وسط غذائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide، ثم يُشفط الوسط الغذائي وتُشطف الطبقة أحادية الخلايا البطانية بـ 10 milliliters من محلول هانكس الملح المتوازن أو HBSS، وبعد ذلك يُشفط HBSS ويُضاف 2 milliliters من محلول 0.5%trips في 0.2%EDTA وتُحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تقريباً، حيث يمكن حينها فصل الخلايا البطانية عن طريق النقر على جانب القارورة. يُضاف 5 milliliters من مثبط التربسين من فول الصويا عبر رشه على سطح القارورة. ولمزيد من فصل الخلايا، تُنقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 milliliter وتُطرد مركزياً عند 200 times G لمدة خمس دقائق، ثم يُشفط السائل الطافي ويُعاد تعليق راسب الخلايا البطانية في 5 milliliters من الوسط الغذائي.قم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) واضبط تركيز الخلايا ليصل إلى 50,000 خلية بطانية لكل مليلتر من الوسط الغذائي. وزع مليلتر واحد من معلق الخلايا في كل بئر من أبار الطبق ذي الـ 24 بئرًا الذي يحتوي على شرائح غطاء زجاجية مغلفة، ثم حضن الخلايا طوال الليل في حضانة زراعة الخلايا عند 37 °C و5% carbon dioxide. وبذلك تصبح الخلايا جاهزة للمعالجة المطلوبة.عندما تتكون طبقة أحادية متصلة في غضون ثلاثة أيام، يتم نقل خلايا HL 60 المستزرعة في وسط RPMI المكمل بـ 10% fetal calf serum إلى أنبوب سعة 15 milliliter وطرد الخلايا مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا في خمسة milliliters من الوسط الخالي من المصل لإجراء الوسم الفلوري لخلايا HL 60. ثم يتم عد الخلايا ونقل الكمية المناسبة منها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter.قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. بعد إزالة السائل الطافي، أعد تعليق كتلة الخلايا في صبغة تتبع الخلايا (cell tracker) في وسط PMI الخاص بنا والخالي من المصل. وبتركيز مليون خلية لكل ملليلتر، حضن الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة، وبعد التحضين، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق وتخلص من السائل الطافي.قم بتعليق الخلايا في الوسط الغذائي بتركيز 2 مليون خلية لكل مليلتر. أضف مليلتر واحد من معلق خلايا HL 60 الموصومة بـ cell tracker إلى كل بئر من بئر لوحة التجميع ذات الـ 24 بئراً التي تحتوي على طبقة أحادية من الخلايا البطانية، ثم قم بتحضين اللوحة في حضانة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون لفترة زمنية محددة تتراوح بين ساعة وثلاث ساعات. بعد فترة التحضين، استخدم ملقطاً دقيقاً من النوع 5B لالتقاط غطاء الشريحة الزجاجي من البئر مع الإمساك بالحافة الخارجية للغطاء فقط، ثم جفف حافة الغطاء.ضع غطاء الشريحة فوق قطعة من المناديل الورقية على طاولة المختبر لمدة ثلاث ثوانٍ. مع الحرص على عدم لمس السطح المغطى بالخلايا من غطاء الشريحة بواسطة المنديل، أمسك غطاء الشريحة بإحكام باستخدام ملقط. اغمر غطاء الشريحة في محلول HBSS ثم أخرجه خمس مرات متتالية، وبعد الغمرة الخامسة.استخدم محلول HBSS لتجفيف حافة الغطاء. مرر المنديل الورقي لمدة ثلاث ثوانٍ. كرر إجراءات الغمر والتجفيف لثلاث مجموعات إجمالية، تتكون كل مجموعة من خمس عمليات غمر تليها عملية تجفيف واحدة.بعد ذلك، انقل غطاء الشريحة إلى بئر يحتوي على محلول التثبيت لتثبيت الخلايا في درجة حرارة الغرفة. يصبح غطاء الشريحة جاهزاً للعد أو للتخزين طويل الأمد أو لإخضاعه لصبغة تباينية للأجسام المضادة أو لنشاط إنزيم بيتا-جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة كما هو موضح في البروتوكول النصي. لعد الخلايا البطانية الملتصقة، يتم تثبيت أغطية الشرائح على شرائح مجهرية مع استخدام صبغة DPI التباينية لتحديد الخلايا الفردية باستخدام مجهر مقلوب بعدسة شيئية بقوة 4x أو 10x. يتم الحصول على صور لعدة حقول وعدّ أعلى عدد من الخلايا الوحيدة التي تتجمع على الخلايا البطانية غير المشععة.حدد ضعف هذا العدد كحد أدنى للمونوسيتات الموجودة على الخلية البطانية لتعريفها كمجموعة (cluster) إذا لزم الأمر. ويمكن استخدام معيار مختلف لتعريف المجموعة بناءً على طبيعة التجربة. قم بعدها عدد المجموعات وعدد الخلايا البطانية في الحقل.اقسم الصيغة على القيمة الأخيرة للحصول على النسبة المئوية للخلايا البطانية الملتصقة. قم بتقدير العديد من المجالات للحصول على المتوسط والانحراف المعياري للتعدادات. ارتبطت الخلايا الوحيدة بالطبقات الأحادية البطانية بعد سبعة أيام من الإشعاع الرمادي وقبل الحضن مع الخلايا الوحيدة في تجمعات حول الخلايا البطانية الفردية.على الرغم من إمكانية ملاحظة هذه الظاهرة بسهولة باستخدام مجهر تباين المرحلة، إلا أن المجهر الفلوري يكشف عن صورة أكثر وضوحاً لتجمعات الخلايا الوحيدة. وبعد إجراء مقايسة ADI الموصوفة، يمكن البدء في صبغ الخلايا لبروتينات الغشاء أو السيتوبلازم أو البروتينات النووية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة. وعند استخدام طرق التألق المناعي القياسية، يجب توخي الحذر أثناء خطوات الغسيل لأن القوة المفرطة قد تؤدي إلى إزاحة الخلايا الوحيدة.علاوة على ذلك، يمكن إجراء مقايسات تعتمد على الإنزيمات مثل مقايسة β-galactosidase المرتبطة بالهرم. يؤدي ذلك إلى تحول الليزوزومات في الخلايا الهرمة إلى اللون الأزرق، كما هو واضح في الخلية البطانية المرتبطة انتقائيًا بالعديد من الخلايا الوحيدة التي يتم التعرف عليها بسبب صغر حجمها وشكلها الكروي. وبما أن كل تجمع من الخلايا الوحيدة يتوافق مع خلية بطانية فردية، فإن تعداد هذه التجمعات يكشف عن العدد الفعلي للخلايا البطانية اللاصقة داخل الطبقة الأحادية، ومن ثم النسبة المئوية للخلايا البطانية اللاصقة ضمن المجموعة.تعد هذه الطريقة الوحيدة حتى الآن التي تسمح بقياس مدى التصاق الخلايا البطانية إذا رغبنا في ذلك؛ حيث يمكن فصل الخلايا الوحيدة الملتصقة بطبقات الخلايا البطانية أحادية الطبقة باستخدام محلول trypsin EDTA، وقياس الفلورة باستخدام قارئ الأطباق كما هو متبع في الطرق المعاصرة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات مع قضاء وقت ضئيل جداً في العمل اليدوي. ومن المهم تذكر أن جميع خطوات الغسل والغمر يجب أن تُنفذ بطريقة متماثلة وبنفس عدد التكرارات لجميع العينات عند اتباع هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي ومقايسات بيتا غالكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي خصائص الخلايا البطانية اللاصقة مقارنة بتلك غير اللاصقة.

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا البروتوكول هو بسيط مقايسة التصاق البكتيريا التي تتكون في عد الأرقام من مستعمرة بكتيرية تشكيل الوحدات التي انضمت على الخلايا المستنبتة. درس مستقل للadhesin للمقايسة وقوية ، وتستخدم العديد من الاختلافات في معظم المختبرات تعمل على المرضية البكتيرية.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

يوصف لفحص لقياس التردد التصاق حركية التفاعل مستقبلات يجند عندما ترسو على حد سواء الجزيئات على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتمثل هذا الاختبار القائم على ميكانيكيا باستخدام micropipette مضغوطة الإنسان خلايا الدم الحمراء وأجهزة الاستشعار والتصاق αLβ2 إنتغرين وبين الخلايا جزيء التصاق - 1 والتفاعل ومستقبلات يغاندس.

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

في هذا الفيديو ، نوضح فحصا يستخدم الفحص المجهري الفلوري للكشف عن التصاق الخلايا السرطانية بمصائد العدلات خارج الخلية (NETs). في آبار الاختبار ، هناك زيادة ملحوظة في عدد الخلايا السرطانية المصنفة بالفلورسنت والتي تلتصق ب NETs ، في حين أن الآبار المعالجة ب DNase تظهر انخفاضا في التصاق الخلايا السرطانية ب NETs.

فحص الالتصاق في المختبر للكشف عن التصاق الخلايا السرطانية بمصائد العدلات خارج الخلية

الانضمام إلى العدلة البطانة تفعيلها في مواقع الإصابة هي جزء لا يتجزأ من استجابة المضيف للالتهابات. وصفها في هذا التقرير هو فحص ملزم العدلة التي تسمح...

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

التوظيف الكرية البيضاء إلى الكبد يحدث داخل القنوات المتخصصة من الجيوب الكبدية التي تصطف من قبل الخلايا البطانية الجيبية الكبدي فريدة من نوعها. المرحلة المجهر النقيض من التوظيف عبر الكرية البيضاء البشرية البطانة الجيبية كبدي تحت ظروف إجهاد القص الفسيولوجية يمكن أن يسهل توضيح الآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه العملية.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

وتفيد التقارير ان طريقة quantitating العدلات التصاق. هذا الأسلوب يخلق بيئة ديناميكية تدفق مماثلة لتلك التي واجهتها في أحد الاوعية الدموية. لأنها تتيح التحقيق في العدلات التصاق إما جزيئات الالتصاق المنقى (يجند) أو البطانية الركيزة الخلية (HUVEC) في سياق مماثل على البيئة في الجسم الحي مع الإجهاد الهائل.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد باستمرار عمليات التصاق الخلايا وإزالة الالتصاق مع القرار الزماني عالية بطريقة غير الغازية التي كتبها مقاومة الخلايا الركيزة والتصوير الخلية الحية تحلل. هذه المقاربات تكشف ديناميات العمليات التصاق الخلية / دي التصاق الناجمة عن تعديل مصفوفة وعلاقتها الزمنية للأحداث الإشارات التي تعتمد على الالتصاق.

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

يوفر هذا الاختبار تدفق التصاق بسيط، نموذج تأثير ارتفاع تي التفاعلات خلية الخلايا الظهارية. ويستخدم ضخ حقنة لتوليد إجهاد القص، ومتحد البؤر المجهر يلتقط الصور لتقدير. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد فعالية الخلايا التائية التصاق باستخدام ظروف التدفق.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

أحكام الضوابط البطانة الوعائية التوظيف الكريات البيض. ويساهم التسرب الكريات البيض غير كافية أمراض التهابات البشرية. ولذلك، تبحث عن رواية العناصر التنظيمية لتفعيل غشائي ضروري لتصميم تحسين العلاج لأمراض التهابات. وهنا يصف لنا منهجية شاملة لتوصيف المنظمين غشائي الرواية التي يمكن تعديلها الكريات البيض الاتجار أثناء التهاب.

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

التصاق دينامية للخلايا المناعية لجدار الوعاء شرطا لصاروخ موجه القناة الهضمية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة وظيفية في المختبر لتحليل تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين أو المستقطبات أو غيرها من العوامل على التصاق الخلية الحيوية للخلايا البشرية باستخدام الشعيرات الدموية المغلفة أدريسين.

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

هنا ، نصف بروتوكولا ، طريقة زراعة الخلايا البطانية الممتدة (EECM) ، والتي تسمح بتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا تشبه الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMEC). تظهر هذه الخلايا تعبيرا جزيئيا عن التصاق الخلايا البطانية ، وبالتالي فهي نموذج حاجز دموي دماغي بشري مناسب لدراسة تفاعلات الخلايا المناعية في المختبر.

تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا شبيهة بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ ذات النمط الظاهري المناعي الناضج

تعلم تقنية كمّية جديدة لقياس التصاق الخلايا البطانية في المختبر باستخدام خلايا الشرايين التاجية البشرية. تتيح هذه الطريقة للباحثين تحديد نسبة الخلايا اللاصقة بدقة عالية بعد المعالجات المختلفة.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي

استكشف المزيد من الفيديوهات