قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تبسيط قراءة فحوصات القطرات الرقمية باستخدام أداة PCR التقليدية في الوقت الفعلي لقياس التألق السائب للمقايس. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد تفاعلات تضخيم للعينات ذات الأهمية أولا ، ومعيارين وتشكيل قطرات لتقسيم كل منها إلى آلاف المفاعلات بحجم النانولترات. الخطوة الثانية هي احتضان القطرات لتضخيم الأحماض النووية داخل كل قطرة.

بعد ذلك ، يتم قياس التألق السائب لكل عينة أو معيار باستخدام QPC قياسي أو دورة حرارية. تتمثل الخطوة الأخيرة في التنبؤ بجزء قطرات الفلورسنت في العينات ذات الأهمية باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه من العينات القياسية. للتحقق من أداء هذه الطريقة ، يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري لتقييم أداء القياس الكمي لمقايسة التألق السائب بشكل مستقل.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل عد القطرات ، هي أنها لا تتطلب أجهزة متخصصة قبل البدء في إصلاح الفحص هذا. جميع الكواشف الضرورية كما هو موضح في نص البروتوكول مطلوب معيارين. واحد ، لا يوجد تحكم في القالب ، مثل الماء الخالي من النوكلياز وتركيز قالب واحد عالي مثل لامدا ، الحمض النووي ، يفسد 3.3 ميكرولتر من كل معيار مع 3.3 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتمسخ في أنبوب A-Q-P-C-R.

احتضنها درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. قم بإخماد كل منها ب 3.3 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحييد. وبالمثل ، قم بتشويط طبيعة 3.3 ميكرولتر من القالب محل الاهتمام مع 3.3 ميكرولتر من عازلة التمسخ باحتضان درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.

اروي ب 3.3 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحييد. قم بإعداد 11 ميكرولترا من الخليط الرئيسي لكل عينة للحصول على عدد أقل من الإيجابيات أو الإيجابيات الخاطئة. قم بتعريض المزيج الرئيسي للأشعة فوق البنفسجية قبل تكوين القطرات.

أولا ، قم بإعداد 10 ميكرولتر من خليط الخلطة الجاهزة لكل عينة في أنبوب شفاف سعة 0.5 مل أو 1.5 مليلتر على الثلج. يتكون خليط الخلط الجاهز من أوليغو عشوائي ، ومحلول تفاعل بوليميراز B-S-A-D-N-A و dn و NTPs وماء خال من نوكلياز. ضع الأنبوب في الماء على الجليد وعرضه للأشعة فوق البنفسجية بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

ملزمة A-D-S-D-N-A والنظام الغذائي المرجعي لخليط الخلط. أضف PHI 29 DNA polymerase أخيرا للتأكد من أن البوليميراز لا يواجه مستويات الأس الهيدروجيني أعلى أو أقل بكثير من 7.5. اخلطي جيدا ، واخلطي 10 ميكرولترات من القالب المشوه أو المعيار و 10 ميكرولترات من الخليط الرئيسي واخلطيهم جيدا.

نظرا لأن القطرات يمكن أن تكون حساسة جدا للكهرباء الساكنة والإجهاد الهائل ، يجب على المجرب إزالة الملابس التي قد تسبب الكهرباء الساكنة وتأريض نفسها في مكانها قبل تكوين القطرات. تم إنتاج جهاز الموائع الدقيقة المستخدم في هذا العرض التوضيحي داخليا ويحتوي على مدخل زيت ومدخلين مائيين مع تقاطع تركيز التدفق لتوليد القطرات. استخدم مضختين حقنة للتحكم في معدلات تدفق 55 ميكرولتر من الزيت مع الفاعل بالسطح و 20 ميكرولترا من خليط التفاعل من خلال رقاقة الموائع الدقيقة.

لتوليد 20،001 قطرة نانولتر ، واحدة من أصعب الخطوات هي جمع القطرات دون إزعاج المستحلب. من المهم استخدام الماصة ببطء ويفضل. استخدم طرف لوح عريض.

اجمع كل القطرات في أنابيب PCR لكل عينة. قم بنقل 30 ميكرولترا من الزيت في أنابيب PCR جديدة بأغطية بصرية باستخدام طرف تجويف عريض وسحب العينة ببطء شديد. انقل 20 ميكرولترا من القطرات فوق الزيت.

تضمن الأحجام المتسقة أن يكون الفحص دقيقا قدر الإمكان. أغلق أغطية الأنبوب بإحكام لأن الأغطية السائبة ستسمح للزيت بتبخر أنابيب مقبض المستحلب من أعلى الأنبوب بعيدا عن المستحلب قدر الإمكان. يمكن استخدام جهاز التدوير الحراري PCR أو جهاز التدوير الحراري A-Q-P-C-R أو الصفيحة الساخنة للتضخيم متساوي الحرارة.

يتم استخدام جهاز التدوير الحراري A-Q-P-C-R في هذا العرض التوضيحي. احتضان العينات لمدة سبع ساعات عند 30 درجة مئوية وتعطيل لمدة دقيقة واحدة عند 75 درجة مئوية. مباشرة بعد رد الفعل والتنشيط.

قياس مستويات التألق لجميع العينات باستخدام جهاز التدوير الحراري QPCR. لكل عينة. اقسم شدة التألق لصبغة ربط الحمض النووي D DS DNA على شدة التألق للصبغة المرجعية.

اطرح تألق الخلفية أو التألق الطبيعي للتحكم بدون قالب من جميع العينات. قم بإنشاء منحنى قياسي خطي باستخدام قياسات التألق التصحيحية من المعايير. يمثل معيار التحكم في عدم وجود قالب التألق لعينة تحتوي على قطرات فلورية 0٪ وتركيز القالب العالي.

قياس التألق هو التألق المتوقع لعينة بها قطرات فلورية بنسبة 100٪ باستخدام المنحنى القياسي المقابل. توقع النسب الوسيطة للقطرات الموجبة والسالبة بناء على تألقها السائب. تستخدم هذه الطريقة أداة PCR التقليدية في الوقت الفعلي لقياس التألق السائب للمقايسات الرقمية القائمة على القطرات.

تم خلط قطرات الفلورسنت وغير الفلورية مسبقا بنسب مختلفة وإجراء مقارنة بين التألق السائب وجزء القطرات الموجبة. كما هو متوقع ، فإن التألق السائب وعدد القطرات الموجبة يتناسع خطيا مع جزء الإدخال لقطرات الفلورسنت. تمت مقارنة النسب المتوقعة بناء على المعايير بكسور الدخل الفلورية المتوقعة.

يشير الخط إلى القيمة المتوقعة بالنظر إلى علاقة خطية. تظهر النتائج أداء جيدا في القياس الكمي لنسبة القطرات عبر سجلين من النطاق الديناميكي. لاختبار هذه الطريقة في مقايسة تضخيم الجينوم الكمي الكامل الحقيقي ، ومستويات التألق ، وكسور القطرات الموجبة للقطرة الرقمية.

تم قياس مقايسة MDA مع زيادة تركيزات قالب Lambda DNA. يشير الخط إلى الكسر الفلوري المتوقع باستخدام توزيع الواissant لنمذجة البيانات من التجربة. يتم عرض صور الفلورسنت التمثيلية للقطرات على حد سواء الفلورسنت السائب وجزء القطرات الموجبة من مقياس عينات MDA الرقمية كما هو متوقع مع متوسط القالب لكل قطرة ، مما يشير إلى أن القراءة المجمعة يمكن أن تلتقط بأمانة نتيجة التقييم الرقمي.

يمكن أن تفيد هذه الطريقة المقايسات الرقمية الأخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي من خلال تسريع قراءة الفحص بالتوازي والتبسيط.