قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تبسيط قراءة فحوصات القطرات الرقمية باستخدام جهاز PCR في الوقت الحقيقي التقليدي لقياس الفلورة الإجمالية للفحص. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير تفاعلات التضخيم للعينات المطلوبة، ومعيارين، وتكوين قطرات لتقسيم كل منها إلى آلاف المفاعلات بحجم النانولتر. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضين القطرات لتضخيم الأحماض النووية داخل كل قطرة.

بعد ذلك، يتم قياس الفلورة الكلية لكل عينة أو معيار باستخدام جهاز QPC قياسي أو جهاز تدوير حراري. وتتمثل الخطوة النهائية في التنبؤ بكسر القطيرات الفلورية في العينات المطلوبة باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه من العينات المعيارية. وللتحقق من أداء هذه الطريقة، يمكن استخدام المجهر الفلوري لتقييم أداء التقدير الكمي لمقايسة الفلورة الكلية بشكل مستقل.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل عد القطيرات في أنها لا تتطلب أجهزة متخصصة. قبل البدء في هذا الفحص، يلزم توفير جميع الكواشف الضرورية كما هو موضح في نص البروتوكول، بالإضافة إلى معيارين: الأول، ضابط خالي من القالب (no template control)، مثل الماء الخالي من النيوكلييز، والثاني تركيز قالب عالٍ مثل lambda DNA. يتم مسخ 3.3 µL من كل معيار باستخدام 3.3 µL من محلول التمسخ المنظم في أنبوب A-Q-P-C-R.

يُحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. يتم إخماد كل عينة بإضافة 3.3 µL من محلول منظم التعادل. وبالمثل، يتم تغيير طبيعة 3.3 µL من القالب المستهدف بإضافة 3.3 µL من محلول منظم تغيير الطبيعة، مع التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.

قم بإخماد التفاعل باستخدام 3.3 µL من محلول التحييد المنظم. جهز 11 µL من الخليط الرئيسي لكل عينة لتقليل النتائج الإيجابية الكاذبة. عرّض الخليط الرئيسي للأشعة فوق البنفسجية قبل تكوين القطيرات.

أولاً، قم بتحضير 10 µL من خليط المزيج المسبق (premix mixture) لكل عينة في أنبوب شفاف سعة 0.5 mL أو 1.5 mL على الثلج. يتكون خليط المزيج المسبق من oligo عشوائي، ومحلول منظم لتفاعل B-S-A-D-N-A polymerase، وdn، وNTPs، وماء خالٍ من النوكلياز. ضع الأنبوب في الماء على الثلج وعرّضه للأشعة فوق البنفسجية (UV light) بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

أضف صبغة ربط A-D-S-D-N-A والنظام الغذائي المرجعي إلى خليط المزيج المسبق. أضف إنزيم PHI 29 DNA polymerase في النهاية لضمان عدم تعرض البوليميراز لمستويات pH أعلى أو أقل بكثير من 7.5. اخلط جيداً، ثم ادمج 10 µL من القالب الممسوخ أو المعيار مع 10 µL من الخليط الرئيسي واخلط جيداً.

بما أن القطيرات يمكن أن تكون حساسة للغاية للكهرباء الساكنة وإجهاد القص، يجب على الباحث خلع الملابس التي قد تسبب كهرباء ساكنة وتأريض نفسها في مكان العمل قبل تشكيل القطيرات. تم إنتاج الجهاز الموائع دقيقية المستخدم في هذا العرض داخلياً، وهو يحتوي على مدخل للزيت ومدخلين للمحاليل المائية مع وصلة تركيز التدفق لتوليد القطيرات. استخدم مضختي حقن للتحكم في معدلات تدفق 55 µL من الزيت مع المادة الخافضة للتوتر السطحي و 20 µL من خليط التفاعل عبر شريحة الموائع الدقيقة.

لتوليد قطرات بحجم 20,001 نانولتر، تعد إحدى أصعب الخطوات هي جمع القطرات دون تعكير المستحلب. ومن المهم استخدام الماصة ببطء، ويفضل استخدام رأس ماصة واسع الفتحة.

اجمع كل القطيرات في أنابيب PCR لكل عينة. وزع 30 µL من الزيت في أنابيب PCR جديدة ذات أغطية بصرية باستخدام رأس ماصة واسع الفتحة مع السحب ببطء شديد. انقل 20 µL من القطيرات فوق الزيت.

تضمن الأحجام المتسقة أن يكون المقايسة دقيقة قدر الإمكان. أغلق أغطية الأنابيب بإحكام لأن الأغطية غير المحكمة ستسمح بتبخر الزيت، وتناول أنابيب المستحلب من الجزء العلوي للأنبوب، بعيداً عن المستحلب قدر الإمكان. يمكن استخدام جهاز التدوير الحراري للـ PCR، أو جهاز التدوير الحراري للـ A-Q-P-C-R، أو لوح تسخين لإجراء التضخيم متساوي الحرارة.

يُستخدم جهاز الدورة الحرارية A-Q-P-C-R في هذا العرض التوضيحي. يتم تحضين العينات لمدة سبع ساعات عند 30 degrees Celsius وتثبيط النشاط لمدة دقيقة واحدة عند 75 degrees Celsius. يتم ذلك مباشرة بعد التفاعل والتنشيط.

قم بقياس مستويات الفلورة لجميع العينات باستخدام جهاز الدورات الحرارية QPCR. وبالنسبة لكل عينة، اقسم شدة فلورة صبغة D DS DNA الرابطة على شدة فلورة الصبغة المرجعية.

اطرح الفلورة الخلفية أو الفلورة الموحدة لعينة الضابطة الخالية من القالب من جميع العينات. أنشئ منحنى قياسياً خطياً باستخدام قياسات الفلورة التصحيحية من المعايير. يمثل معيار الضابطة الخالية من القالب الفلورة لعينة تحتوي على 0% من القطرات الفلورية وتركيز قالب مرتفع.

قياس الفلورة هو الفلورة المتوقعة لعينة تحتوي على قطيرات فلورية بنسبة 100% باستخدام منحنى المعايرة المقابل. يتم التنبؤ بالنسب المتوسطة للقطيرات الإيجابية والسلبية بناءً على الفلورة الإجمالية لها. تستخدم هذه الطريقة جهاز PCR في الوقت الحقيقي تقليدي لقياس الفلورة الإجمالية للمقاييس الرقمية القائمة على القطيرات.

تم خلط قطيرات فلورية وأخرى غير فلورية مسبقاً بنسب مختلفة، وأُجريت مقارنة بين الفلورة الكلية وكَسْر القطيرات الإيجابية. وكما هو متوقع، تتناسب الفلورة الكلية وأعداد القطيرات الإيجابية خطياً مع كَسْر القطيرات الفلورية المدخلة. وتمت مقارنة النسب المتوقعة بناءً على المعايير مع كُسور الإدخال الفلورية المتوقعة.

يشير الخط إلى القيمة المتوقعة بناءً على علاقة خطية. وتظهر النتائج أداءً جيداً في تحديد كمية نسبة القطيرات عبر نطاق ديناميكي يمتد عبر لوغاريتمين. ولاختبار هذه الطريقة في مقايسة كمية حقيقية لتضخيم الجينوم الكامل، تم قياس مستويات الفلورية، وكسور القطيرات الإيجابية لقطيرة رقمية.

تم قياس مقايسة MDA باستخدام تركيزات متزايدة من قالب Lambda DNA. ويشير الخط إلى الجزء الفلوري المتوقع باستخدام توزيع بواسون لنمذجة بيانات التجربة. تظهر الصور الفلورية التمثيلية للقطرات كل من الفلورية الكلية وجزء القطرات الإيجابي من عينات MDA الرقمية، والتي تتناسب كما هو متوقع مع متوسط القالب لكل قطرة، مما يشير إلى أن القراءة الكلية يمكن أن تلتقط بدقة نتيجة المقايسة الرقمية.

يمكن لهذه الطريقة أن تفيد المقايسات الرقمية الأخرى مثل PCR الرقمي من خلال تسريع عملية القراءة المتوازية وتبسيطها.