إعداد التنسيق المسامية العالية البوليمر طلاء البوليمر على ماكروبوروس كتل لتعزيز إثراء Phosphopeptides

الهدف العام من التجربة التالية هو إعداد مادة دعم جديدة ذات أداء محسن في الاستخراج الانتقائي لببتيدات الفوسفو. يتم تحقيق ذلك من خلال التحضير السليم لمتراصة شعرية من البوليمر المسامية مع مجموعات وظيفية مناسبة. أولا ، يتم تثبيت نوع معدني على المجموعات الوظيفية لمتراصة البوليمر ، مما يجعل الدعم انتقائيا لاستخراج ببتيدات الفوسفو.

يتم إجراء النمو التالي خطوة بخطوة لطبقات متعددة من الإطار العضوي المعدني من أجل زيادة كمية المواقع المعدنية ، وبالتالي زيادة انتقائية الببتيدات الفوسفورية. أظهرت النتائج انتقائية محسنة لاستخراج ببتيدات الفوسفو من هضم البروتين بناء على تأين الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة ، ووقت قياس الطيف الكتلي للطيران. عادة ما يتم تخصيب الببتيد O عن طريق كروماتوغرافيا تقارب الأسد المعدني ، والتي يتم إجراؤها إما على جزيئات السيليكا التقليدية أو جزيئات البوليمر ، والتي يتم تعبئتها في عمود كروماتوغرافي.

مادتنا بين مزايا متراصة البوليمر الكبيرة التي يسهل اختراقها ، والتي تتميز بخصائص نقل جماعي جيدة مع قدرة الربط العالية للإطار العضوي المعدني. الطريقة التي نحقق بها ذلك هي عن طريق النمو التتابع للإطار العضوي المعدني من سطح المتراصة بحيث يكون لدينا في النهاية طبقات متعددة من الخطوط المعدنية المتاحة للتفاعل مع المادة التحليلية ، والعرض المرئي لتحضير متراصة البوليمر ونمو الإطار العضوي المعدني كلاهما مهم لأنه من الصعب جدا تعلمهما. هناك العديد من الخطوات المهمة التي يجب على المرء الانتباه إليها من أجل تحقيق متراصة ذات خصائص سطحية جيدة ومسامية.

للبدء ، قم بقص مترين من الشعيرات الدموية المصنوعة من السيليكا المنصهرة المطلية بمادة البولي أميد وقطرها الداخلي 100 ميكرون متصلة بحقنة زجاجية من 25 مليلتر وغسل الشعيرات الدموية بالأسيتون. ثم قم بإزالة الأسيتون عن طريق شطف الشعيرات الدموية بالماء. بعد ذلك ، ضع حقنة زجاجية سعة 250 ميكرولتر مملوءة بهيدروكسيد الصوديوم المائي 0.2 مولار على مضخة الحقنة وقم بتدفق المحلول عند نقطة 25 ميكرولتر في الدقيقة عبر الشعيرات الدموية لمدة 30 دقيقة من أجل تنشيط طلاء السيليكا الداخلي.

بعد 30 دقيقة ، اشطف الشعيرات الدموية بالماء حتى تصبح النفايات السائلة محايدة. استخدم شرائط الأس الهيدروجيني الورقية للتحقق من تدفق الأس الهيدروجيني المحايد. قم بتحميل المحقنة ب 0.2 مولار من كلوريد الهيدروجين المائي وضخ المحلول عبر الشعيرات الدموية عند نقطة 25 ميكرولتر في الدقيقة لبروتونات مجموعات ciol بعد 30 دقيقة من التدفق ، مرة أخرى ، اشطف الشعيرات الدموية بالماء حتى يصبح التدفق محايدا.

بمجرد أن يصبح الرقم الهيدروجيني محايدا ، اشطف الشعيرات الدموية بحقنة سعة 250 ميكرولتر مملوءة بالإيثانول بنسبة 100٪. ثم قم بضخ محلول 20٪ من ثلاثة ثلاثي ميثيل بروبيل ميثاكريلات في الإيثانول عند نقطة 25 ميكرولتر في الدقيقة لمدة ساعة واحدة لتشغيل السطح بمجموعات الفينيل. بعد ذلك ، اشطف الشعيرات الدموية بالأسيتون ثم جففها بتيار من النيتروجين.

دع العينات ترتاح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ، ثم قم بتقطيعها إلى أقسام بطول 20 سم. تحضير خليط البلمرة في قارورة زجاجية سعة ملليلتر واحد مع حاجز مطاطي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. أضف 1٪ A IBN فيما يتعلق بالمونومرات كبادئ وصوتنة الخليط لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بإرفاق شعيرات شعرية من السيليكا غير الوظيفية بتيار نيتروجين وإدخالها من خلال الحاجز المطاطي في خليط البلمرة. قم بفك غطاء القارورة قليلا وقم بفقاعة النيتروجين ببطء في الخليط لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، ارفع الشعيرات الدموية لتيار النيتروجين من خليط البلمرة إلى مساحة رأس القارورة وأغلق الغطاء بإحكام.

أدخل أحد الشعيرات الدموية الوظيفية من خلال الحاجز في خليط البلمرة. استخدم الضغط الزائد الناتج عن النيتروجين لضخ خليط البلمرة إلى الشعيرات الدموية الوظيفية. اسمح لعدة قطرات من خليط البلمرة بالتدفق من النفايات السائلة للشعيرات الدموية للتأكد من ملئها بالكامل ، ثم أغلقها بحاجز مطاطي.

أخرج الشعيرات الدموية من القارورة بعناية فائقة وأغلق المدخل بحاجز مطاطي ، ضع خليطا موجودا في الشعيرات الدموية في حمام مائي ساخن عند 60 درجة مئوية لمدة ست ساعات حتى يتبلمر. عند الانتهاء ، قم بتبريد الشعيرات الدموية إلى درجة حرارة الغرفة ثم اقطع بضعة ملليمترات من طرفي الشعيرات الدموية. بعد ذلك ، استخدم مضخة HPLC لشطف العمود ب Acetonitrile بمعدل أربعة ميكرولتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

سيؤدي ذلك إلى إزالة أي مونومرات غير متفاعلة وعوامل تشكيل ضعيفة. تحقق من الضغط الخلفي للعمود الشعري. بعد ذلك ، قم بغسل الكتلة المتراصة الشعرية في دورات باستخدام الكواشف الموضحة هنا لتنمية الطلاء العضوي المعدني النهائي.

يتم تحديد سمك الطلاء من خلال عدد الدورات التي تم إجراؤها. اغسل الشعيرات الدموية بالطلاء العضوي المعدني المحضر باستخدام 100 ميكرولتر من خليط من أربعة إلى واحد من تجربة الأسيتونيد وحمض الخليك المائي 0.1٪. ثم ضخ هضم البروتين عبر العمود بسرعة ميكرولتر في الدقيقة.

لمدة 30 دقيقة ، اغسل الببتيدات غير الفسفرية مرة أخرى بمزيج من أربعة إلى واحد من تجربة أسيتيل NI وحمض أسيتيك ثلاثي فلور المائي 0.1٪ لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الدقيقة. يغسل بالماء لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الدقيقة. قم بإزالة ببتيدات الفوسفو باستخدام محلول عازل فوسفات 250 ميكرومولار عند درجة الحموضة سبعة عن طريق ضخها عبر الشعيرات الدموية بسرعة ميكرولتر واحد في الدقيقة لمدة 15 دقيقة ، وجمع ellu في قارورة وتحلية المحلول باستخدام بروتوكول قياسي.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول ملليغرامين لكل مليلتر من خمسة حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك في الميثانول ، واخلط ميكرولترين من هذا المحلول مع ميكرولترين من محلول ببتيد الفوسفو المشار إليه. داخل طرف الماصة ، ضع هذا الخليط مباشرة على لوحة التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة ، واترك البقعة تجف تماما. قم بتحليل البقع عن طريق الليزر بمساعدة المصفوفة وقت تأين الامتصاص لقياس الطيف الكتلي للطيران أخيرا يجدد العمود عن طريق شطفه جيدا بالماء ، متبوعا بشعيرات الدموية الميثانول المعدلة بطبقات متعددة من الحديد المتاح.

ثلاث مجموعات مثالية للاستخدام في كروماتوغرافيا تقارب أيونات المعادن المحركة الموضحة هنا هي الأطياف التي تم الحصول عليها من البروتينات المهضومة قبل وبعد التخصيب ، مما يظهر انتقائية رائعة ل 12 ببتيدا فوسفويا مختلفا. توفر تجارب التوصيف التمثيلية معلومات قيمة حول ظهور مسام جديدة. فيما يلي صورة لكتلة متراصة للمسحوق السائبة بعد 30 دورة بوليمر تنسيق مسامية تعرف باسم دورات PCP باستخدام مجهر إلكتروني ماسح.

بعد 30 دورة PCP ، وجد أن حجم عرض المسام في المادة أقل من ثلاثة نانومتر في القطر مقارنة بالبوليمر السائب. يحتوي الهجين على كمية كبيرة من المساحة الإضافية ذات المسام الصغيرة. هذا يؤدي إلى زيادة امتصاص النيتروجين من خلال مجموعة من الضغوط باستخدام التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه.

كان الدمج الأولي للمجموعات الوظيفية الكربوكسيلية مرئيا بالإضافة إلى نمو الطلاء بعد 10 و 20 و 30 دورة PCP. أخيرا ، تم استخدام التحليل الوزني الحراري لقياس كمية المواقع المعدنية الإضافية التي تتراكم مع كل دورة. يظهر هنا تحليل القياس الوزني من خلال مجموعة من درجات الحرارة ، مما يؤكد وجود عدد متزايد من المواقع المعدنية مع زيادة عدد الدورة.

باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تطوير إجراء مماثل لمراكز المعادن المختلفة في الروابط العضوية من أجل استهداف الفصل الفعال للتحليلات المختلفة بناء على تقاربها مع إطار معين. أعتقد أن المواد المركبة مثل موادنا التي تجمع بين البوليمرات الكبيرة التي يسهل اختراقها والأطر العضوية المعدنية تحمل وعدا كبيرا في مجال علم الفصل لأنها يمكن أن تحسن بشكل كبير من انتقائية قدرة الربط والكفاءة الإجمالية للفواصل ، سواء في المقياس التحليلي أو التحضيري.