Microbead زرع الأجنة الزرد

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام غرس الخرزات الدقيقة لإحداث تغييرات في بيئة الأنسجة المحلية عند نقاط مكانية وزمنية محددة أثناء تكوين الجنين في أسماك الزيبرا. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير صينية غرس الخرزات لتسهيل التعامل الدقيق مع الخرزات الدقيقة وغرسها. وكخطوة ثانية، يتم تحضين بيوض أسماك الزيبرا حتى تصل إلى مرحلة النمو المطلوبة.

يتم بعد ذلك تحضير الخرزات الدقيقة في المحاليل التجريبية المناسبة ونقلها بعناية إلى الموقع المطلوب داخل الجنين. وفي النهاية، يمكن إجراء عملية زرع الخرزات الدقيقة دون تعطيل التطور الطبيعي لسمك الزيبرا، مما يسمح بتقييم تأثيرات الجزيئات محل الدراسة على التكون الجنيني لسمك الزيبرا. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا التطور، مثل كيفية تأثير الجزيئات المختلفة على عملية تخلق الأعضاء؟

بشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، حيث يتطلب الأمر تدريبًا لإتقان التعامل مع الخرزات الدقيقة (microbeads). لتحضير صينية زرع الخرزات الدقيقة، يتم أولاً تسخين محلول 2%aro المحضر حديثًا لمدة 90 ثانية. يتم ذلك في دورق إرلنماير سعة 250 milliliter، مع تدوير الدورق كل 30 ثانية لمنع فوران الهلام.

بعد ذلك، ضع غطاء طبق بتري مقاس 60 × 15 مليمتر داخل طبق مقاس 150 × 15 مليمتر بحيث يكون الجزء الداخلي من الغطاء متجهًا للأعلى. ثم قم بتثبيت غطاء طبق بتري الأصغر باستخدام إصبع السبابة، واسكب هلام الأجار الساخن في الطبق الأكبر.

اترك طبقة رقيقة من agros تتشكل أسفل الغطاء الأصغر لمنع تكوّن التكثيف ولتسهيل رؤية الخرز تحت المجهر أثناء تبريد agros. وقبل أن يتصلب، قم بإمالة قالب الفجوة ببطء داخل الجزء العلوي من الهلام لتسهيل وضع الأجنة. وعندما يتصلب الهلام، استخدم ملعقة دقيقة (micros spatula) لإزالة قالب الفجوة بعناية.

ثم أضف محلول E three إلى الطبق واحفظه في درجة حرارة 4 °C. ولجمع أجنة أسماك الزيبرا، املأ غرفة التزاوج بمياه النظام. بعد ذلك، ضع فاصلاً في منتصف الغرفة وأضف ذكور وإناث أسماك الزيبرا البالغة في الجوانب المناسبة من الغرفة.

في صباح اليوم التالي، استخدم مصفاة سلكية دقيقة لجمع البيض المخصب. اقلب المصفاة رأسًا على عقب داخل طبق بتري نظيف بقطر 10 centimeter، واشطف الشبكة بتيار رفيع من محلول E three حتى لا يتبقى أي بيض في المصفاة، ويصبح هناك ما يقرب من 25 milliliters من محلول E three في الطبق. بعد ذلك، وزع البيض على عدة أطباق بمعدل 50 إلى 60 بيضة لكل طبق لتجنب الازدحام، واحضر البيض في محلول E three عند درجة حرارة 28.5 degrees Celsius؛ وقبل زراعة الخرزات الدقيقة، قم بحضن البيض في الحجم المناسب من الجزيء المختبر أو المادة المرجعية (control vehicle) للمدة الزمنية المناسبة.

بعد ذلك، وعندما تصل الأجنة إلى النقطة الزمنية التنموية المطلوبة، استخدم ملقطاً دقيقاً لإزالة الـ kons وقم بحضن أسماك zebrafish في محلول ringer المفلتر، والمعزز بالمضادات الحيوية لمدة 10 دقائق بينما تتأقلم الأجنة. انقل الخرزات الدقيقة (micro beads) إلى طبق الخرزات الدقيقة الذي تم تحضيره مسبقاً، والموضوع داخل صينية الزرع، ثم اشطف الخرزات ومحلول ringer لمدة 10 دقائق.

في غضون 50 دقيقة من غسل الخرزات، يتم ترتيب الجنين تلو الآخر داخل بئر صينية الزرع، بحيث تكون منطقة زرع الخرزات المجهرية متاحة. وباستخدام إبرة تنجستن، يتم إجراء شق صغير في الجنين، ثم يتم الضغط على بصيلة ماصة نقل شعيرية دقيقة لسحب خرزة مجهرية بلطف إلى العمود الشعيري، ثم تحرير الضغط لإيصال الخرزة المجهرية إلى صينية الزرع لتسهيل التعامل معها. يتم دفع الخرزة بلطف لغمرها في محلول رينجر داخل القالب.

بعد ذلك، وباستخدام الإبرة الدقيقة، حرك الخرزة الدقيقة فوق الجنين وادفعها داخل الشق. وأخيرًا، استخدم أداة التحريك (whisker tool) لإبعاد الخرزة الدقيقة عن موقع الشق لضمان عدم طردها أثناء التئام الجرح. ويمكن بعد ذلك تقييم نجاح زرع الخرزة الدقيقة فورًا عبر المجهر المجسم، حيث ستظل الخرزة مستقرة في موقعها داخل النسيج.

في هذه التجربة، تم زرع خرزات دقيقة مفردة من حجمين مختلفين، تم شطفها بمحلول رينجر وحده، في أجنة أسماك الزيبرا عند مرحلة برعم الذيل، أو في نقاط زمنية لاحقة خلال عملية تكوين العضلات لضمان عدم إزاحة موقع الخرزة على مدى فترة التجربة بسبب التشكل النسيجي الداخلي. يمكن معاينة عينات الأجنة عن طريق التصوير الفوتوغرافي لمسار الحياة أو فحصها على فترات زمنية دورية كما توضح الصور عملية زرع الخرزات الدقيقة. وفي غياب أي مواد مقترنة، يمكن تحقيق ذلك باستخدام جزيئات صغيرة دون حدوث تأثيرات مورفولوجية جسيمة خلال التطور الطبيعي لجنين سمكة SPR.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل Whole Mount In Situ Hybridization لدراسة كيفية تأثير الخرزة الدقيقة (Microbead) على التعبير الجيني. وبشكل عام، يعد فهم موضع الخرزة بمرور الوقت أمراً بالغ الأهمية في تفسير النتائج، مثل تقييم تأثيرات جزيء صغير على نسيج مستهدف أو عملية نمو وتطور.