مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء غرفة انتشار متدرج المسوي للتحقيق في ضرائب العلاج الكيميائي في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع قالب سيليكون ثلاثي الأبعاد أولا باستخدام غرفة تصوير الخلايا الحية. الخطوة الثانية هي عمل زلات غطاء محبة للماء ومسعور واستخدامها لتجميع قالب السيليكون ثلاثي الأبعاد.

بعد ذلك ، يضاف خليط خلايا الكولاجين إلى الحجرة المركزية ويسمح له بالبلمرة. تتمثل الخطوة الأخيرة في إزالة زلات الغطاء الكارهة للماء من القالب بعد الحضانة وإضافة وسائط عادية إلى خزان واحد ووسائط مع جاذب كيميائي إلى الخزان الآخر. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتتبع الانجذاب الكيميائي للخلية بمرور الوقت وتصور إزاحة حركة الخلية داخل مصفوفة الكولاجين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل غرفة boin وألعاب القوى الصغيرة ، هي أنها تسمح بإعداد بسيط للتحقيق في الهجرة في الفضاء ثلاثي الأبعاد مع تدرج انتشار بسيط ، لا تستخدم ماصة يمكن التخلص منها. قم بقياس 150 ميكرولتر من مادة السيلين الأمينية A-P-T-M-S واسكبها في أنبوب سعة 50 مل. ثم أضف 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب باستخدام ماصة ثانية يمكن التخلص منها ، وأغلق الغطاء.

دوامة المحلول لمدة دقيقتين لضمان الخلط الكامل. ثم يسكب المحلول في طبق بتري زجاجي ويترك جانبا. بعد ذلك ، صب 15 مل من الكحول الإيثيلي بنسبة 100٪ في طبق بتري ثان وضعه مع الطبق الأول باستخدام ماصة جديدة يمكن التخلص منها.

قم بقياس 30 مل من الماء منزوع الأيونات واسكب المحلول في أنبوب سعة 50 مل. بعد ذلك ، استخدم ماصة جديدة يمكن التخلص منها لإضافة 1.875 مل من الألدهيد جلو إلى الأنبوب وإغلاق الغطاء. دوامة المحلول لمدة دقيقتين ، ثم صب الخليط في طبق بتري ثالث.

باستخدام ملقط ، أخرج 1 غطاء زجاجي دائري مقاس 22 ملم واشطف كلا الجانبين بخليط الإيثانول بنسبة 100٪. باستخدام ماصة يمكن التخلص منها ، ضع غطاء زجاج الشطف في الطبق الأول الذي يحتوي على السيلين الأميني واتركه في المحلول لمدة خمس دقائق باستخدام الملقط. أخرج زلة الغطاء الزجاجي واشطفها مرة أخرى باستخدام 100٪ من الإيثانول.

ثم قم بإسقاط الغطاء الزجاجي المغسول ، وانزلق في الطبق مع الجلوتارالديهايد واتركه جانبا لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة زلة الغطاء الزجاجي بالملقط واشطفها بالماء منزوع الأيونات. ضع زلة الغطاء المغسولة على منديل حتى يجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

لتحضير زلات الغطاء الكارهة للماء ، أضف أولا 500 ميكرولتر من TTS و 100 ميكرولتر من حمض الأسيتيك و 19.4 مل من الهين في أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بدوامته لمدة دقيقتين. ثم صب المحلول في طبق بتري زجاجي واستخدم ملقطا نظيفا لإسقاط غطاء زجاجي واحد ، وانزلق في المحلول المحضر واتركه هناك لمدة دقيقتين. بعد دقيقتين ، أخرج زلة الغطاء الزجاجي باستخدام ملقط واشطفها بالماء منزوع الأيونات باستخدام ماصة يمكن التخلص منها ، ضع زلة الغطاء على منديل واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

قم بتخزين شرائح الغطاء المجففة في طبق بتري بلاستيكي حتى تكون هناك حاجة للبدء ، وقم بتجميع غرفة تصوير الخلية الحية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، قم بخلط محاليل المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لصنع خمسة ملليلتر من المطاط الصناعي. ثم استخدم ملعقة مختبر يمكن التخلص منها لصب محلول المطاط الصناعي السيليكوني ببطء في إعداد غرفة تصوير الخلايا الحية حتى لا تزعج مكونات القالب.

ضع القالب جانبا في مكان آمن لتنظيم درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اسحب القالب باستخدام ملقط واستخرج بعناية مكعب معدني من الألومنيوم من القالب. بعد ذلك ، انتقل إلى الحوض واشطف القالب بالماء منزوع الأيونات ، ثم ضع القالب على منشفة ورقية حتى يجف.

بمجرد أن يجف ، استخدم سكين هواية لقطع مساحة الشقوق بمسافة 2.34 ملم عن كل طرف طولي داخل قالب السيليكون. تأكد من بقاء القالب في مكان آمن وجاف لحين الحاجة للتجربة قبل الاستخدام. اشطف القالب بنسبة 90٪ من الإيثانول وضع القالب في طبق بتري مملوء بالماء منزوع الأيونات ليجلس طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، انقل القالب إلى منشفة ورقية واتركه يجف في الهواء أثناء تجفيف القالب. استخدم أداة كتابة ماسية عالية الدقة لقطع المربع. ينزلق الغطاء المحب للماء إلى مستطيلين ، أكبر قليلا من 3.95 ملم × 5.99 ملم.

ثم حرك كل غطاء من الغطاء المستطيل المقطوع في الفتحات ، وقم بتقطيعه إلى قالب السيليكون ، واقلب القالب رأسا على عقب وقم بتطبيق الشحم المفرغ على طول الجزء السفلي من قالب السيليكون باستخدام ماصة يمكن التخلص منها. بعد ذلك ، اقلب القالب للخلف على الجانب الأيمن لأعلى واضغط على الجزء السفلي من القالب على زلة الغطاء الزجاجي الدائري المحب للماء. لإنشاء ختم ، قم بإعداد خليط من الوسائط والجاذب الكيميائي في أنبوب سعة 15 مليلتر بالتركيز المطلوب ، وقم بإدخال خمسة ملليلتر من الخليط في أنبوب مليلتر جديد وخمسة ملليلتر من الوسائط العادية في أنبوب ثان.

انقل كلا الأنبوبين إلى حمام مائي ساخن إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، ضع الماصة 30 ميكرولترا من 10 XPBS في أنبوب طرد مركزي صغير. أضف ستة ميكرولترات من محلول هيدروكسيد الصوديوم العادي في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق والدوامة لمدة 15 ثانية.

ثم أضف 18 ميكرولترا من كربوكسيل الفلورسنت الأخضر الأصفر ، والكريات المجهرية المعدلة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق و 168.3 ميكرولتر من الجليد البارد. اكتب كولاجين ذيل الفئران واحدا. دوامة الخليط لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، أضف 77.7 ميكرولتر من الخلية المطلوبة. اكتب في مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر في الوسائط إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير واخلطه. باستخدام طرف ماصة لمدة 20 ثانية، ضع الماصة 300 ميكرولتر من خليط خلايا الكولاجين في البئر الأوسط لمجموعة القالب المحضر.

ثم ضع القالب على طبق بتري يمكن التخلص منه وانقله إلى حاضنة قياسية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد فترة الحضانة ، استخدم الملقط لإزالة كل من زلات الغطاء الكارهة للماء عن طريق التثبيت على الجزء العلوي من كل زلة غطاء ، ثم سحبها لأعلى وبعيدا عن القالب. انقل النظام بأكمله إلى المجهر وافحص الغرفة للتأكد من أن جوانب قالب الكولاجين لا تزال مستقيمة ، مما يسمح بتدرج انتشار المسوي مع نظام لا يزال تحت المجهر. أضف 100 ميكرولتر من وسائط الخلية في البئر الأول.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط الخلية بتركيز الجاذب الكيميائي المطلوب في البئر على الجانب الآخر من المصفوفة. تتبع هجرة الخلايا في إشارة إلى الكريات المجهرية المسماة بالفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. تظهر سلسلة الصور المعروضة هنا انتشار الرمل الذي يتحرك عبر هلام كولاجين واحد ملليغرام لكل مليلتر.

يعرض هذا المثال تدرج الانتشار المستوي الحقيقي للنظام ، والذي يمكن توقعه أيضا من أي جاذبات كيميائية تم إدخالها. في المثال الموضح هنا ، تم قياس شدة إشارة الكرم بمرور الوقت في المواقع التي تحددها المربعات الحمراء. يظهر التركيز في كل موقع من هذه المواقع في هذا الرسم البياني كخط منفصل ، والذي عند قياسه في حالة مستقرة ، ينتج تدرجا خطيا للتركيز بناء على الموضع في الجل.

تظل هذه العلاقة خطية في جميع أنحاء مجموعة من تركيزات مصفوفة الكولاجين مما يجعل هذا النظام مفيدا جدا لتجارب الخلايا. في هذه الصورة ، يظهر عدلات باللون الأحمر داخل مصفوفة كولاجين متناثرة مع كريات مجهرية خضراء فلورية تستخدم كمراجع للموضع. تظهر الصور الثلاث التالية الهجرة الموجهة للعدلات أثناء تحركها لأعلى تدرج جاذب كيميائي ، والذي يصوره السهم الأبيض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء غرفة انتشار بسيطة للتحقيق في هجرة الخلايا في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد.