Name: الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي السالمونيلا في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: اكتشف كيفية تحديد نسبة السالمونيلا العصارية والرغوية في الضامة باستخدام التفاضلية Permeabilization. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم تفاعلات المضيف مع الممرض داخل الخلايا.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نعترف ماتياس S. ديك، رولاند F. دراير وسيباستيان رول للمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل SNSF الأستاذية PP00P3_139120 / 1 وجامعة بازل منحة المشروع ID2153162 لPB

<ol><li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leading+a+sheltered+life%3A+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li>
<li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li>
<li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li>
<li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li>
<li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li>
<li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11%3A+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li>
<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells%3A+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732(2012).</li>
<li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+%28IRG+proteins%29+triggers+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288(2009).</li>
<li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li>
<li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+guanylate+binding+protein+2+%28mGBP2%29+controls+Toxoplasma+gondii+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681(2014).</li>
<li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac%2FDIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298(2012).</li>
<li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li>
<li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116(2013).</li>
</ol>

ليس لدينا ما نكشف عنه.

permeabilization الفرق هو طريقة سهلة وقوية لتحليل وتحديد التوزيع التحت خلوية من مسببات الأمراض البكتيرية بين المقصورات فجوي والعصارة الخلوية. وقد استخدم نفس الفحص بنجاح مع البكتيريا مثل الفرنسيسيلة القتولة 2،4 والشيجلا الفلكسنرية 12. ومع ذلك، لأن العديد من العوامل المسببة للأمراض الخلايا تغير أو تعدل الهياكل endomembrane المضيف، فإن متانة permeabilization ديجيتونين يجب أن يتحدد على أساس فردي. صقل للفحص فيما يتعلق الممرض أو خلية خط المستخدمة ...

مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا تتكاثر بشكل مباشر في العصارة الخلوية الخلية المضيفة، أو في حجرات فجوي المتخصصة 1. خلال المرحلة الأولى من العدوى الحصول المنضوية معظم مسببات الأمراض إما عن طريق البلعمة من قبل خلايا متخصصة (مثل الضامة) أو عن طريق بنشاط على تعزيز امتصاص الخاصة بهم في الخلايا غير البلعمية. في الخلايا البلعمية، ويبلوع الصمامات عادة مع الجسيمات الحالة لتشكيل المقصورة الهادمة، حيث يتم هضمها الجسيمات المبتلعة. البكتيريا عصاري خلوي المتخصصة، مثل الفرنسيسيلة القتولة أو الشيجلا الفلكسنرية، هربا من تدهور phagosomal عن طريق حفز تمزق يبلوع والهروب في وقت لاحق إلى 2،3 العصارة الخلوية. وهذا يتطلب آلية المرتبطة الفوعة مثل الإمراضية جزيرة الفرنسيسيلة (FPI) أو الشيجلا الفلكسنرية T3SS، الذي يحقن البروتينات المستجيب التي تعزز فجوي تمزق 2-4. الميزات العصارة الخلوية الخلية المضيفةعدد من الحفظ مستقبلات التعرف على الأنماط التي تعترف عادة وجود مسببات الأمراض وتحفيز المناعة الفطرية يشير 5. بالإضافة إلى ذلك، xenophagy، وهو شكل المضادة للميكروبات من الالتهام الذاتي يمكن أن تتحلل البكتيريا التي تدخل العصارة الخلوية. وعادة تكييفها البكتيريا عصاري خلوي جيدا لفظة أو الالتفاف على هذه الردود باستخدام استراتيجيات مختلفة. على سبيل المثال، الفرنسيسيلة يعدل LPS لتجنب الاعتراف المضيفة والشيجلا يمنع تجنيد الالتهام الذاتي باستخدام البروتينات المستجيب يفرز 6،7. يعمل استراتيجية أخرى للهروب من تدهور الليزوزومية من النموذج فجوي الممرض السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية، أشار بعد ذلك إلى أنه السالمونيلا التيفية الفأرية. يستخدم السالمونيلا وT3SS لحقن المستجيبات أن يعيد يبلوع الأولي إلى مكانته داخل الخلايا، والسالمونيلا التي تحتوي فجوة (SCV) 8،9. التلاعب المستمر لمسارات المضيفمن الضروري الحفاظ على هذا فجوة من خلال تجنيد الدهون والمواد المغذية الأخرى إلى فجوة. في الواقع، يفشل متحولة سيفا من السالمونيلا للحفاظ على الاستقرار فجوي، ويدخل في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة في غضون ساعات بعد الإصابة، مما يؤدي إلى تفعيل مسارات المناعية الفطرية والتوظيف الالتهام الذاتي 8. الهروب فجوي السالمونيلا يختلف باختلاف نوع من الخلايا التي هي الدراسات، وأظهرت عدة تقارير أنه في الخلايا الظهارية حتى WT السالمونيلا يمكن الهروب من SCV وhyperreplicate في العصارة الخلوية 10. وتشير التقارير الأخيرة التي كشف المناعي الفطري من مسببات الأمراض فجوي يعتمد أيضا على قدرة المضيف على الاعتراف وزعزعة استقرار الفجوات التي تحتوي على العوامل المسببة للأمراض (PCVS) 11-14. وبالنظر إلى أن كلا من المضيف أو البكتيريا النمط الجيني يمكن أن تؤثر على توزيع البكتيريا داخل الخلايا بين فجوي ومقصورة عصاري خلوي، فمن الضروري تحديد عدد فجوي مقابلالبكتيريا عصاري خلوي. منذ ذلك الحين، في معظم الاجهزة التجريبية مصابون الخلايا المضيفة مع بكتيريا أكثر من واحد، وبعد ذلك يمكن أن تؤوي العديد من البكتيريا في مقصورات التحت خلوية مختلفة، وهناك حاجة وهي تقنية تسمح الكمي على مستوى البكتيريا واحدة. permeabilization التفاضلي (المعروف أيضا باسم فحص حماية phagosomal) يوفر هذا القرار 2،4،10،12. ويستند الفحص على permeabilization الانتقائي للخلايا المضيفة غشاء البلازما مع ديجيتونين المنظفات، مما يترك الأغشية فجوي سليمة، وبالتالي يسمح تلطيخ الانتقائي للبكتيريا عصاري خلوي مع الأجسام المضادة. هنا نقدم بروتوكولين لتقدير حجم عصاري خلوي وفجوي السالمونيلا التيفية الفأرية باستخدام الفرق permeabilization. يوصف مبدأ هذه الطريقة في الشكل 1: مصابون نقي العظم الضامة المشتقة (BMDMs) مع مرحلة ثابتة mCherry، معربا عن السالمونيلا. مرحلة ثابتة السالمونيلا بحاجة رس استخدامها لأنها downregulate التعبير عن SPI-1 T3SS، التي لولاها أن تعترف بها inflammasome NLRC4 واستحثاث موت الخلايا السريع (pyroptosis) من BMDMs 15 النشاط. بعد الإصابة تغسل الخلايا وتعامل مع 50 ميكروغرام / مل من ديجيتونين لمدة 1 دقيقة. تغسل الخلايا مرة أخرى على الفور وحضنت مع الأجسام المضادة السالمونيلا مكافحة بالإضافة إلى FITC بمناسبة البكتيريا من الوصول إلى العصارة الخلوية. بعد غسل إضافي وهي lysed خلايا خطوة ونسبة mCherry + (فجوي) وFITC + / + mCherry (عصاري خلوي) البكتيريا يتم تحديدها من قبل FACS. نحن أيضا الإبلاغ عن التكيف مع هذه الطريقة التي يمكن استخدامها إذا لم السلالات، معربا عن بروتين فلوري المتاحة (الشكل 2). يتم تقديم خطوات إضافية بعد وضع العلامات FITC التي يتم إصلاحها الخلايا وpermeabilized تماما. بعد ذلك تم تلطيخ كل البكتيريا مع الأجسام المضادة السالمونيلا مكافحة وما يقابلها من الأجسام المضادة الثانوية. ديتثم يتم ection بواسطة المجهر بدلا من تحليل FACS.

<table><tbody><tr><td>ديجيتونين</td><td>سيجما</td><td>D5628</td><td>50 & جم / مل</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات البوتاسيوم</td><td>سيجما</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td> <td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>مضاد للسالمونيلا CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>مضاد للسالمونيلا CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>مضاد ل Calnexin</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>مضاد ل PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield تركيب متوسط</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة للأرانب -488</td><td>الجزيئية مجسات</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 & mu ؛ جم / مل و 10 مو ؛ جم / مل</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 مجهر متحد البؤر</td><td>تصوير Zeiss</td><td></td><td>تم إجراؤه في 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD للكشف</td><td></td><td>عن تقنيات mCherry 610 نانومتر</td></tr>كشف <tr><td>تقنيات</td><td></td> <td>FACS Fortessa</td> BD <td>FITC 530 نانومتر</td></tr></tbody></table>

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

يمكن مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا تكرار في العصارة الخلوية أو في فجوات التي تحتوي على العوامل المسببة للأمراض المتخصصة (PCVS). للوصول إلى العصارة الخلوية، مثل البكتيريا الشغيلة الفلكسنرية والفرنسيسيلة القتولة تحتاج للحث على تمزق يبلوع. في المقابل، السالمونيلا التيفية الفأرية يتطابق في مقصورة فجوي، والمعروفة باسم السالمونيلا التي تحتوي فجوة (SCV). فشلت المسوخ ولكن بعض من السالمونيلا للحفاظ على سلامة SCV، وبالتالي فهي تطلق في العصارة الخلوية. النسبة المئوية للعصاري خلوي مقابل البكتيريا فجوي على مستوى البكتيريا واحدة يمكن أن يقاس permeabilization التفاضلي، المعروف أيضا باسم فحص يبلوع الحماية. نهج يجعل من استخدام خاصية المنظفات ديجيتونين لربط بشكل انتقائي الكولسترول. منذ غشاء البلازما يحتوي على أكثر الكولسترول من الأغشية الخلوية الأخرى، ديجيتونين يمكن استخدامها لpermeabilize انتقائي غشاء البلازما بينما يترك الخلايا الأغشيةسليمة. وباختصار، بعد العدوى مع الممرض تعبر عن البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال mCherry وغيرها)، وpermeabilized الغشاء البلازمي للخلايا المضيفة مع حضانة قصيرة في ديجيتونين تحتوي على العازلة. ثم يتم غسل الخلايا وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية (بالإضافة إلى fluorophore الاختيار) موجهة ضد البكتيريا الاختيار (مثل مكافحة السالمونيلا -FITC) وغسلها مرة أخرى. إذا تم استخدام البكتيريا تحمل علامات، ويمكن أن يتم خطوة إضافية، والتي هي permeabilized جميع أغشية وجميع البكتيريا ملطخة الضد المقابل. بعد التلوين، نسبة فجوي وعصاري خلوي البكتيريا يمكن أن يكون كميا بواسطة FACS أو المجهري عن طريق عد أحداث مفردة أو مزدوجة إيجابية. نحن هنا تقديم تفاصيل تجريبية لاستخدام هذه التقنية مع بكتيريا السالمونيلا التيفية الفأرية. الاستفادة من هذا الاختبار هو أنه، على النقيض من فحص آخر، فإنه يوفر الكمي على مستوى bacte واحدريا، واذا ما تم تحليلها بواسطة المجهر توفر العدد الدقيق للعصاري خلوي والبكتيريا فجوي في خلية معينة.

الرقم 1 والرقم 2 تظهر الخطط للمقايسة ديجيتونين هو موضح في البروتوكول 1 و 2 بروتوكول توضح الخطوات الحاسمة في البروتوكول والنتائج التي تم الحصول عليها. ويبين الشكل 3 النتائج FACS نموذجية. تستخدم الضوابط الإيجابية والسلبية لضبط بوابات للmCherry + / البكتيريا FITC- (فجوي السالمونيلا) وmCherry + / FITC + البكتيريا (عصاري خلوي السالمونيلا). وبناء على هذه البوابات نسبة البكتيريا عصاري خلوي وفجوي يمكن تحديد في العينات التجريبية. في هذا المثال قمنا بالمقارنة ...

نصف القياس الكمي للسالمونيلا التيفيموريوم العصاري الخلوي والفراغي في البلاعم المشتقة من نخاع العظام باستخدام نفاذية الديجيتونين التفاضلية.

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد النسبة المئوية لبكتيريا salmonella tym السيتوبلازمية والفجوية في البلاعم المشتقة من نخاع العظم المصابة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة البلاعم ببكتيريا salmonella Ty aerium التي تعبر عن M cherry. وكخطوة ثانية، تُعالج الخلايا بالمنظف tonin، الذي ينفذ الغشاء البلازمي، ولكن ليس الأغشية الفجوية.بعد ذلك، تُصبغ الخلايا باستخدام جسم مضاد للسالمونيلا مقترن بصبغة فلورية. ومن أجل وسم السالمونيلا السيتوسولية، تُظهر النتائج النسبة المئوية للبكتيريا السيتوسولية من إجمالي البكتيريا بناءً على فرز الخلايا المنشط فلورياً (FACS). يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التفاعل مع المسببات المرضية، مثل: هل يتكاثر المسبب المرضي داخل الخلوي في الفجوة (VA) أم في السيتوسول؟ قم بتلقيح السلالة البكتيرية قبل يوم واحد من العدوى في 3 mL من وسط Luria britani المكمل بـ streptomycin و ampicillin في هزاز عند 37 °C طوال الليل لمراعاة الظروف الفردية. أضف شرائح غطاء إلى آبار طبق 24 بئرًا والتي ستُستخدم كعناصر تحكم لزراعة الخلايا من أجل العدوى؛ ازرع الخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم من النوع البري (BMDMs) بكثافة 0.125 مليون خلية لكل بئر في 1 mL من وسط الخلايا البلعمية الأساسي، ثم حضن الخلايا طوال الليل في حاضنة عند 37 °C و 5% CO2.في اليوم التالي. يتم تحديد تركيز السالمونيلا في المزرعة الليلية عن طريق قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر أو OD 600 للمزرعة المخففة مقابل محلول ملحي منظم بالفوسفات. يضمن ذلك قياس OD 600 ضمن النطاق الخطي لجهاز المطياف الضوئي.قم بحساب تركيز السالمونيلا (salmonella) لكل مليلتر، حيث تعادل قيمة OD 600 الواحدة مليار بكتيريا. قم بتخفيف البكتيريا في وسط البلعوميات (macrophage medium) للوصول إلى تركيز سالمونيلا يبلغ 1.25 مليون خلية لكل مليلتر لإصابة الخلايا بالسالمونيلا. قم بإزالة الوسط من خلايا B MDMs.أضف 1 mL من وسط زراعة الخلايا البلعمية (macrophage medium) إلى آبار المجموعة الضابطة غير المصابة، من B1 إلى B3 ومن C1 إلى C3. ثم أضف 1 mL من معلق السالمونيلا (salmonella suspension) إلى الآبار من A1 إلى A5 للوصول إلى تعدد عدوى (multiplicity of infection) يبلغ 10 بكتيريا لكل خلية. قم بطرد اللوحة مركزياً لمدة 15 دقيقة عند 300 ×g و37 °C لمزامنة العدوى قبل نقل اللوحة لتحضينها عند 37 °C و5% CO2 لمدة ساعة واحدة بعد الإصابة. أخرج اللوحة من الحاضنة لإضافة 0.1 mL من وسط زراعة الخلايا البلعمية المحتوي على Gentamycin لقتل البكتيريا خارج الخلوية.أضف الجنتاميسين إلى جميع الآبار، بما في ذلك عينات الضبط غير المصابة، لضمان معاملة جميع الخلايا بنفس الطريقة. بعد ذلك، انقل الطبق إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون بعد مرور ساعتين من العدوى. أخرج الطبق من الحاضنة واغسل جميع الآبار مرتين باستخدام 1 mL من وسط DMEM (وسط إيجل المعدل) الذي تم تدفئته مسبقاً.استبدل وسط DMEM بوسط زراعة البلاعم المجهَّز مسبقاً والمدعم بالجينتاميسين لمنع نمو أي بكتيريا خارج خلوية متبقية، وذلك قبل إعادة الطبق إلى الحاضنة قبيل نقطة التحليل الزمنية المطلوبة. قم بتحضير محاليل طازجة من منظم KHM buffer، وKHM buffer مع digitonin، وKHM buffer مع saponin. وبالإضافة إلى محاليل الأجسام المضادة الموصوفة في البروتوكول النصي لإجراء نفاذية الخلايا، أخرج الطبق من الحاضنة واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 0.5 milliliters من منظم KHM buffer المجهَّز مسبقاً.بعد ذلك، قم بإزالة منظم KHM وأضف 0.25 milliliters من منظم KHM العادي إلى الآبار A4 وB1 وC1، ومنظم KHM مع digitonin إلى الآبار من A1 إلى A3 وB2 وC2، ومنظم KHM مع saponin إلى الآبار A5 وB3 وC3. يتم التحضين لمدة دقيقة واحدة بالضبط في درجة حرارة الغرفة قبل غسل جميع الآبار فوراً ثلاث مرات باستخدام 0.5 milliliters من منظم KHM المسخن مسبقاً. أخيراً، قم بإزالة منظم KHM وأضف محاليل الأجسام المضادة الأولية إلى الآبار المناسبة قبل تحضين الطبق لمدة 15 minutes عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide. بعد التحضين، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 milliliter من PBS للخلايا المصابة في الآبار من A1 إلى A5.استعد لتحليل FACS عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف 0.5 milliliters من PBS المبرد على الثلج والذي يحتوي على 0.1%Triton. بعد ذلك، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب FACS سعة خمسة milliliters مزود بغطاء مصفاة للخلايا لتفكيك تجمعات الخلايا مع الحفاظ على العينات مبردة على الثلج.قم بتحليل العينات باستخدام جهاز FACS بالاعتماد على الضوابط النفوذة كلياً. حدد البوابة الخاصة بإجمالي البكتيريا بناءً على التشتت الأمامي والجانبي وإشارة mCherry. بعد ذلك، قم بتحليل إشارة fitz في مجتمع البكتيريا الكلي باستخدام الضوابط النفوذة وغير النفوذة لتحديد بوابات البكتيريا السيتوبلازمية والبكتيريا الفجوية مع ضبط البوابة.قم بتحليل العينات وتحديد النسبة المئوية للبكتيريا السيتوزولية مقابل البكتيريا الفجوية باستخدام برنامج FlowJo. وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة لضوابط النفاذية غير المصابة في الآبار من B1 إلى B3 ومن C1 إلى C3، قم بالتحضير للفحص المجهري عن طريق إزالة PBS وإضافة 250 µL من 4% Paraform aldehyde في PBS، ثم حضن العينات لمدة 10 دقائق عند 37 °C بعد عملية التحضين. اغسل الآبار مرتين باستخدام 1 mL من PBS، ثم أضف 250 µL من 0.1 M glycine في PBS لمدة 10 دقائق لإيقاف عمل المثبت، وبعد ذلك اغسل الآبار مرتين باستخدام 1 mL من PBS لإجراء صبغ الأجسام المضادة الثانوية.قم بصبغ ضوابط النفاذية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام أجسام مضادة ثانوية مناسبة مقترنة بالفلوروفورات في محلول PBS، المضاف إليه 0.1% saponin و 3% BSA. ولضمان نفاذية الخلايا بالكامل، اغسل الشرائح الغطائية ثلاث مرات باستخدام 1 mL من محلول PBS، ثم قم بتثبيت الشرائح الغطائية للتحليل في وسط تثبيت يحتوي على DAPI.قم بتحليل شرائح الغطاء مع الضوابط بتكبير 40 x أو 63 x باستخدام مجهر فلوريسنتي بؤري. تظهر هنا النتائج النموذجية. تُستخدم ضوابط النتائج الإيجابية والسلبية لضبط البوابات للبكتيريا الإيجابية لـ m cherry والإيجابية لـ Fitz، والتي تكون سيتوزولية (في السيتوزول)، وهي السالمونيلا، والبكتيريا الإيجابية لـ m cherry والسلبية لـ FITSI، وهي السالمونيلا الموجودة في الفجوات.بناءً على هذه البوابات، يتم تحديد النسبة المئوية للبكتيريا السيتوزولية والبكتيريا الفجوية في العينات التجريبية. في هذا المثال، تمت مقارنة سلالة *Salmonella typhimurium* البرية الموجبة لبروتين m cherry مع طفرة حذف CA في الخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم MI. الموضح هنا هو تلوين calnexin و PD one الذي تم الحصول عليه في ضوابط النفاذية المعالجة بـ digitonin أو saponin؛ وبما أن calnexin هو بروتين غشاء الشبكة الإندوبلازمية، يمكن رؤية تلوين calnexin في جميع أنحاء السيتوزول وحول النواة في الخلايا المنفذة بـ digitonin و saponin. أما في ضوابط النفاذية بـ digitonin، فلا يظهر أي تلوين لـ PD one.بينما يمكن ملاحظة التلوين في خلايا sasin و perme. تظهر هنا نتيجة تلوين مضاد للسلمونيلا في الخلايا التي تمت نفاذيتها باستخدام tonin. تظهر البكتيريا الكلية باللون الأحمر بينما تظهر البكتيريا السيتوبلازمية باللون الأخضر.تمثل المجموعة الإيجابية لـ E بكتيريا السالمونيلا التي وصلت إلى السيتوسول. بينما تمثل المجموعة السلبية لـ fite البكتيريا التي تستقر داخل فجوة تحتوي على السالمونيلا تكون سليمة، والمعروفة بـ SCV، وبالتالي تكون محمية من وسم السالمونيلا بـ FSE. هنا، تتم مقارنة السالمونيلا من النوع البري بسلالة طافرة بها حذف لـ CFE. وبما أن CA ضروري للحفاظ على سلامة SCV، فإن نسبة مئوية متزايدة من السالمونيلا تكون [نص ناقص في المصدر]. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد النسبة المئوية للبكتيريا الموجودة في الفجوات والسيتوسول.

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

في هذه المقالة، نحن وصف طريقة استخدام متعددة الأطياف التدفق الخلوي التصوير لقياس استيعاب النانوية polyanhydride أو البكتيريا بواسطة الخلايا 264.7 الخام.

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

يوضح هذا الفيديو فحصا لتحديد النمو داخل الخلايا للطفيليات في الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMMs). تصاب خلايا البلاعم بالمراحل الغازية المتحركة وغير المتحركة من الليشمانيا ، والبروماتيجوت metacyclic و amastigotes ، على التوالي. تغزو الطفيليات الضامة ، وتتداخل في فجوة طفيلية وتتكاثر في الداخل. يتم قياس نمو الطفيليات داخل الخلايا باستخدام مجهر عند تلطيخ البلاعم ونواة الطفيليات بالفلورسنت.

اختبار في المختبر لتحديد نمو الطفيليات داخل الخلايا في البلاعم

يوضح هذا الفيديو فحصا لتحديد كمية السالمونيلا التيفيموريوم العصارية الخلوية والفراغية داخل البلاعم المشتقة من نخاع العظام باستخدام النفاذية التفاضلية. تصاب البلاعم بالسالمونيلا التي تعبر عن البروتين الفلوري ، والتي يتم استيعابها داخل بنية فجوية متخصصة تسمى الفجوة المحتوية على السالمونيلا أو SCV. تهرب مجموعة فرعية من البكتيريا من SCV وتدخل العصارة الخلوية. يتم اختراق غشاء البلازما الغني بالكوليسترول من البلاعم باستخدام الديجيتونين ، مما يترك SCV سليما. عند تصنيف البكتيريا العصارية الخلوية بجسم...

اختبار لتحديد السالمونيلا العصارية الخلوية والفراغية في البلاعم الأولية المصابة

نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل...

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

وتم إعداد مقايسة الإنتاجية العالية لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو، وتكرارها في الخلايا البلعمية مع القدرة الإنتاجية العالية. وقد استخدمت طريقة لتقييم السالمونيلا خروج المغلوب الجينات سلالات متحولة للتدخلات في التفاعلات المضيف الممرض.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري السالمونيلا الملهبة لل جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة التي كتبها التصوير الخلية الحية وكميا.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

يقيم جميع الأنواع الليشمانيا المسببة للأمراض وتكرارها داخل الضامة مضيفيهم الفقاريات. نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب موريني الضامة المشتقة من نخاع العظام في الثقافة مع ليشمانيا، متبوعاً بالقياس الكمي الدقيق لحركية النمو داخل الخلايا. يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة العوامل الفردية التأثير على التفاعل المضيف الممرض وضراوة الليشمانيا .

التحديد الكمي "النمو داخل الخلايا داخل الضامة" هو سريع وطريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم الفوعة طفيليات الليشمانيا

مطلوب للحفاظ على التوازن افيروسيتوسيس، إزالة متجولة للخلايا أبوبتوتيك، ويسر مستقبلات ومسارات الإشارات التي تسمح للاعتراف، والإحاطة، واستيعاب الخلايا أبوبتوتيك. وهنا، نقدم بروتوكول الفحص المجهري الأسفار لتقدير افيروسيتوسيس ونشاط مسارات إشارات افيروسيتيك.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس استخدام الفلورية الخضراء تعزيز البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية.

استخدام تعزيز الفلورية الخضراء البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس

تغزو السالمونيلا وتتكاثر داخل الخلايا الظهارية المعوية في كل من الفجوات العصارية الخاصة بالسالمونيلا والحرة في السيتوسول (فرط التكاثر). يتم وصف بروتوكول قائم على الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية هنا لتحديد الأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا من خلال تحليلين متكاملين للصور من خلال ImageJ ، للوصول إلى دقة الخلية الواحدة والتسجيل.

التحليل الآلي للأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا باستخدام ImageJ

اكتشف كيفية تحديد نسبة السالمونيلا العصارية والرغوية في الضامة باستخدام التفاضلية Permeabilization. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم تفاعلات المضيف مع الممرض داخل الخلايا.

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي

استكشف المزيد من الفيديوهات