العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

الهدف العام من اختبار تهيج العين هو تصنيف المواد والمخاليط وتصنيفها وفقا لإمكانية تهيج العين. يستخدم هذا الإجراء نموذجا ثلاثي الأبعاد معاد بناؤه مثل الأنسجة. عند الوصول ، يتم تحضين مجموعة الاختبار مسبقا طوال الليل في وسط الفحص في اليوم التالي ، ويتم ترطيب الأنسجة ، متبوعا بالتطبيق الموضعي للضوابط الإيجابية والسلبية ومواد الاختبار الكيميائية ذات الأهمية على أسطح الأنسجة في نسختين.

بعد فترة محددة من التعرض ، تتم إزالة المواد الكيميائية عن طريق الغسيل. يتم تحضين الأنسجة بعد ذلك في وسط فحص جديد ثم يتم تقييم سمية المواد الكيميائية بواسطة مقايسة MTT. في النهاية ، يمكن تقييم الإمكانات المزعجة لمواد الاختبار من خلال مقارنة الجدوى النسبية للأنسجة المعالجة بمادة الاختبار بالأنسجة المعالجة ذات التحكم السلبي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل اختبارات تهيج التتبع السريع ، هي أنها لا تشمل المختبر. يستخدم في المختبر كورنال مفكك مثل نموذج الأنسجة العينية ، والذي يتكون من خلايا بشرية طبيعية. إنه قابل للتطبيق على جميع أنواع المواد والمخاليط ويمكن أن يميز بين المواد الكيميائية التي تسبب تهيج العين أو تلف العين الخطير من المواد.

غير المهيجات التي لا تتطلب التصنيف ووضع العلامات. القرنية البشرية المعاد بناؤها مثل الأنسجة الظهارية أو epi. يتم تحضير العين في إدخالات بغشاء مسامي تنتقل من خلاله العناصر الغذائية إلى الخلايا.

تشكل الأنسجة المعاد بناؤها ظهارة غير متقرنة تصمم ظهارة القرنية مع خلايا طبقية تدريجيا ولكن ليست مقرنة. عند استلام القرنية البشرية مثل مجموعة الظهارة ، قم بموازنة الأنسجة في حاوية الشحن 24 بئر إلى درجة حرارة الغرفة بعد 15 دقيقة ، افتح الكيس الذي يحتوي على صفيحة مناديل 24 جيدا في ظل ظروف معقمة وافحص جميع الأنسجة بحثا عن فقاعات الهواء بين هلام agros والإدخالات. قص. افتح الشريط.

قم بإزالة الغطاء بشاش معقم وافحص سطح الأنسجة. بعد ذلك ، قم بإدخال ملليلتر واحد من وسط فحص مجموعة 37 درجة مئوية في آبار ستة ألواح آبار مسبقة التصنيف. ثم استخدم ملقطا معقما لمسح الأنسجة التي تحتوي على إدخالات برفق على شاش معقم لإزالة أي شحن متبقي ووضعها في آبار فردية من ألواح الآبار الستة.

بعد ساعة واحدة ، استبدل الوسط بملليلتر واحد من وسط الفحص الطازج 37 درجة مئوية ، واحتضن الأنسجة في ظل ظروف الاستزراع القياسية طوال الليل. في اليوم التالي ، قمت بتنظيف 20 ميكرولترا من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم على السطح القمي لكل نسيج. إذا لم ينتشر DPBS عبر الأنسجة ، فأمسك الملحق برفق باستخدام ملقط واضغط على اللوحة للتأكد من أن المحلول الملحي يبلل سطح الأنسجة بالكامل.

احتضن الأطباق لمدة 30 دقيقة. ثم لمعالجة الأنسجة بمواد اختبار السائل ، قم بتطبيق 50 ميكرولترا من التحكم السلبي والتحكم الإيجابي ومقالات الاختبار المناسبة في نسختين وفقا للجدول الزمني. احرص على التأكد من أن العلاجات تغطي أسطح الأنسجة بالكامل ثم احتضان الإدخالات لمدة 30 دقيقة لمعالجة الأنسجة بمواد اختبار صلبة.

أولا ، انقل الإدخالات إلى سطح معقم. حافظ على اللوحة مغطاة لمنع التلوث بالجزيئات الصلبة المحمولة جوا. ثم باستخدام ملعقة مستوية ، ضع موضعيا 50 ملليغرام من مقالة الاختبار على الأنسجة المكررة وفقا للجدول الزمني ، مع الحرص على أن يغطي العلاج سطح الأنسجة بالكامل.

بدلا من ذلك ، استخدم حقنة ملليلتر واحدة معبأة مسبقا مع قطع الرأس. لوضع المساحيق مباشرة على المزرعة. اضغط على المكبس لتطبيق المسحوق مباشرة بعد تطبيق مواد الاختبار الصلبة ، وأعد الإدخالات إلى ألواح البئر الستة واحتضان الأنسجة لمدة ست ساعات لشطف الأنسجة.

بعد العلاج ، املأ 3 150 مليلتر أكواب لكل مادة اختبار ب 100 مل من DPBS في نهاية حضانة التعرض. أمسك الحافة العلوية للإدخالات بالملقط المنحني لإزالتها من الآبار. ثم باستخدام الملقط ، التقط إدخالين من نفس العلاج من حوافهما العلوية وصب العلاجات على مادة ماصة نظيفة.

بعد ذلك ، اغمس الإدخالات في أول دورق من DPBS لغسل الأنسجة بحركة دائرية لمدة ثانيتين. ثم ارفع الإدخالات بحيث تمتلئ في الغالب ب DPBS وصب السائل مرة أخرى في الدرق. كرر الغسيل مرتين في الدورق الأول.

ثم اشطف الحشوات في الأكواب الثانية والثالثة من DPB S3 مرات كل منهما بنفس الطريقة بعد الغسيل الأخير. قم بتدوير كل إدراج بزاوية 45 درجة تقريبا بحيث يكون الطرف المفتوح متجها لأسفل ولمس الشفة العليا بالمادة الماصة لصب أي DPBS متبقية. ثم اغمر الأنسجة على الفور في خمسة ملليلتر من وسط فحص درجة حرارة الغرفة.

في صفيحة 12 بئر مسبقة التسمية في نهاية فترة الغمر بعد النقع ، قم بصب وسط الفحص وصمة عار الإدخالات على مادة ماصة. ثم انقل الإدخالات إلى صفيحة جديدة مكونة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر واحد من وسط الفحص الدافئ لكل بئر ، ووضع الألواح في الحاضنة لبدء اختبار قابلية MTT. انقل الإدخالات إلى صفيحة 24 بئر تحتوي على 0.3 مل من محلول MTT المحضر حديثا.

ربت على الإدخالات على المادة الماصة قبل النقل. حرر أي فقاعات هواء محاصرة أسفل الإدخالات وأعد الأنسجة إلى الحاضنة بعد ثلاث ساعات ، وقم بوضع قيعان الإدخالات على المادة الماصة. ثم للاستخراج المغمور لمواد اختبار السائل غير الملونة ، اغمر الإدخالات في صفيحة 24 بئر مسبقة التسمية تحتوي على ملليلترين من محلول الاستخراج المناسب لكل بئر لاستخراج غير مغمور من الملونات الصلبة أو السائلة.

انقل الإدخالات إلى صفيحة من ستة آبار مسبقة التسمية تحتوي على ملليلتر واحد من محلول الاستخراج لكل بئر. ثم أغلق الألواح بمادة مانعة للتسرب حراري أو شكلي لمنع التبخر واستخراجها على شاكر مداري لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف في نهاية الاستخراج المغمور. ثقب الأنسجة ثم صب السائل داخل كل إدخال مرة أخرى في ، ثم تخلص من الإدخالات مع الأنسجة.

امزج محلول الاستخراج في كل بئر وانقل حصتين من 200 ميكرولتر من كل عينة إلى الآبار المناسبة للوحة 96 بئر مسبقة التسمية كما هو موضح في التخطيطي في نهاية الاستخراج غير المغمور. تجاهل الإدخالات والأنسجة دون ثقب وإضافة مليلتر واحد من محلول الاستخراج لكل منها. قم بخلط محلول الاستخراج جيدا في الآبار وانقل حصتين من 200 ميكرولتر من كل عينة إلى الآبار المناسبة للوحة 96 بئر مسبقة كما هو موضح للتو.

أخيرا ، اقرأ الكثافة البصرية للعينات في مقياس الطيف الضوئي 96 بئرا بطول موجي 570 نانومتر دون استخدام مرشح مرجعي وأدخل النتائج في جدول بيانات لحساب التزامات الأنسجة المعنية. ضع في اعتبارك التصحيحات الناتجة عن التداخل الكيميائي للاختبار كما هو موضح في بروتوكول النص هنا ، تظهر نتائج اختبار تهيج العين التمثيلية التي أجريت مع 10 مقالات اختبار وعناصر تحكم سلبية وإيجابية في هذه التجربة. لوحظ متوسط كثافة بصرية قدره 1.31 للتحكم السلبي المقابل لبقاء الأنسجة بنسبة 100٪ مع بقاء نسبي للأنسجة بنسبة 31.2٪ بالنسبة لاختبار التحكم الإيجابي ، أظهرت مقالات اختبار المراقبة 1 و 2 و 4 و 7 و 8 اختلافات في الأنسجة تزيد عن 60٪ لتصنيف هذه المواد على أنها مواد اختبار غير مهيجة 3 و 5 و 6 و 9 و 10.

من ناحية أخرى ، أظهرت اختلافات في الأنسجة أقل من أو تساوي 60٪ مما أدى إلى تصنيفها على أنها مهيجات. كان الفرق في صلاحية الأنسجة بين الأنسجة المكررة في هذه التجربة أقل من 20٪ لجميع المقالات التي تم اختبارها باستثناء مادة الاختبار الثانية. لذلك ، تم اعتبار نتائج جميع مقالات الاختبار باستثناء المادة الثانية مؤهلة لأنها استوفت جميع معايير قبول اختبار تهيج العين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار DICATION ، باستخدام القرنية البشرية الترميمية في المختبر مثل نموذج الأنسجة الرابع ، ووضع العلامات على تحديد المخاطر للمادة الكيميائية. تم تنفيذ هذا الإجراء في إرشادات اختبار EOC D كجزء من استراتيجية اختبار المستوى.