تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم استقلاب الأحماض الدهنية في الخلايا الكبدية الأولية للفئران. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تروية كبد الفأر بوسط هضمي، ثم استئصاله، وبعد ذلك عزل الخلايا الكبدية. وتتمثل الخطوة الثانية في زراعة الخلايا الكبدية على أطباق مطلية بالكولاجين.

بعد ذلك، تُعالج الخلايا الكبدية بالتدخلات التجريبية المراد اختبارها. وتتمثل الخطوة النهائية في تحضين الخلايا بوجود مادة ركيزة مُعلمة إشعاعياً. وفي الختام، يُستخدم تحليل الوميض السائل لإظهار تأثيرات التدخلات الدوائية أو الجينية المختلفة على إما أكسدة الأحماض الدهنية أو عملية تخليق الدهون في الخلايا الكبدية الأولية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على عدة أسئلة رئيسية في مجال التمثيل الغذائي والسكري، بما في ذلك كيفية تأثير التدخلات الدوائية والجينية المحددة على بيولوجيا الخلايا الكبدية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لسببين؛ أولاً، يصعب تحقيق ظروف تروية محددة تؤثر على صحة الخلايا الكبدية، وثانياً، تقدير كمية ثاني أكسيد الكربون المنطلق.

الغازات ليست بديهية. سيقوم توم أكي، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. قم بإعداد المضخة 연بذية بوضع أحد طرفي الأنبوب المعقم في وسط تروية الكبد المسخن مسبقاً، والطرف الآخر في حاوية النفايات.

شغّل المضخة حتى يمتلئ كامل طول الأنبوب بالوسط الزرعي. بعد التضحية بالفأر المستهدف، رُش بطن الفأر بسخاء بـ 70% ethanol. ثم استخدم مقصاً ذا طرف غير حاد لإجراء شق طولي في منتصف الجلد على طول البطن، ثم قم بإزاحة الجلد جانبياً.

قم بإجراء شق مماثل في البريتون لكشف الأحشاء. وباستخدام أداة غير حادة، أزِح الأمعاء برفق. ولكشف الأوعية الدموية البطنية، حدد موقع الوريد الأجوف السفلي البطني وضع غرزة جراحية أسفل الوعاء الدموي في نقطة قاصية بالنسبة للوريد الكلوي، وقاصية بالنسبة للغرزة.

ضع إبرة وقسطرة في الوريد الأجوف السفلي وقم بدفعها إلى ما بعد الغرزة. بينما لا تزال الإبرة في مكانها، اربط الغرزة حول القسطرة لتثبيتها، ثم قم بإزالة الإبرة بعناية. إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح، فسيتدفق الدم عبر القسطرة باستخدام ماصة.

املأ المنطقة المتبقية في القسطرة بوسط التروية وتأكد من عدم وجود أي فقاعات هواء. بعد ذلك، وبمنتهى الحذر، قم بتوصيل الأنبوب بالقسطرة. ثم، قم بثقب الحجاب الحاجز بعناية باستخدام مقصات ذات طرف حاد، واصنع شقاً جانبياً للكشف عن التجويف الجنبي.

مع الحرص على تجنب المرارة والأوعية الدموية الجنبية، ضع ملقط بولدوغ حول الوريد الأجوف السفلي الصدري في المنطقة التي تسبق الوريد الكبدي مباشرة. بعد ذلك، اقطع الوريد البابي وشغل المضخة بمعدل ثلاثة إلى أربعة milliliters per minute. قم بتروية الكبد باستخدام وسط تروية الكبد لمدة خمس دقائق، وباستخدام 20 milliliters تقريبًا من وسط التروية.

خلال هذا الوقت، لاحظ التغير اللوني الفوري للكبد من اللون الأحمر إلى اللون البني الرمادي. وإذا ظلت أجزاء من الكبد حمراء، فهذا يشير إلى ضعف التروية، مما يقلل بشكل كبير من احتمالية نجاح عملية العزل. بعد إتمام التروية لمدة خمس دقائق، أوقف المضخة وانقل الأنابيب إلى وسط هضم الكبد.

أعد تشغيل المضخة وقم بتروية الكبد لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة أخرى، بمعدل ثلاثة إلى أربعة milliliters per minute حتى ينفد الوسط. وفي نهاية عملية التروية، أوقف المضخة.

يجب أن يكون للكبد لون مائل للوردي وأن يبدو متضخماً نوعاً ما. في هذه المرحلة، يتم استئصال الكبد عن طريق التشريح الدقيق. ثم يُنقل إلى طبق زراعة أنسجة بقطر 10 centimeter وتُزال المرارة.

بعد ذلك، أضف 10 milliliters من وسط الزرع إلى الكبد، وابدأ في كشط الكبد برفق باستخدام مشرط. ولإزالة الخلايا الكبدية، قم بترشيح المعلق باستخدام مصفاة خلايا بمسامية 100 micron وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اغسل الطبق بـ 10 milliliters إضافية من وسط الزرع واسحب السائل إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter.

بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا في صورة كريات عند درجة حرارة 4 °C عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق وبقوة 350 Gs، ثم يُشفط الوسط ويُعاد تعليق كريات الخلايا في 10 milliliters من وسط الزرع. بعد ذلك، يُضاف 10 milliliters من السيليكا الغروية بتركيز 90% المغلفة بـ polyvinyl perone مع الخلط برفق، ثم يتم تجميع الخلايا في صورة كريات كما في الخطوة السابقة. وبعد عملية الطرد المركزي، تُشفط طبقة الخلايا الميتة العائمة على سطح الخليط.

بعد ذلك، اغسل الخلايا المترسبة الحية مرتين باستخدام 20 milliliters من وسط الزراعة. أعد تعليق الراسب الخلوي النهائي في 10 milliliters من وسط الزراعة وقم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ضع 90,000 خلية في كل بئر من أطباق زراعة ذات 24 بئرًا مغطاة بالكولاجين. حضن الأطباق عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة تتراوح بين 16 إلى 20 ساعة قبل بدء المقايسة.

اغسل الخلايا مرتين بمحلول PBS دافئ وانقل الخلايا إلى وسط تجويع من المصل خالي من المصل يحتوي على 20 nanomoles من glucagon. حضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% carbon dioxide في صباح يوم إجراء المقايسة.

قم بتحضير وسط ما قبل التحضين ثم استبدل وسط تجويع المصل. وسط لوسط ما قبل التحضين. يتم تحضين الخلايا في هذا الخليط عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين أثناء عملية التحضين.

جفف 0.5 micro curies لكل بئر من C 14 palmitate عن طريق تبخير مذيب الإيثانول تحت تدفق النيتروجين قبل حوالي 15 دقيقة من نهاية فترة الحضن، ثم أعد تعليق C 14 palmitate بمعدل 12.5 microliters لكل micro curie في 0.1 Normal sodium hydroxide، واحضن الخليط عند 70 °C لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف ثلاثة أضعاف الحجم من وسط ما قبل الحضن الدافئ، واخلط المزيج عن طريق السحب والدفع بالممصّة.

أضف 25 µL من خليط C 14 palmitate المخفف إلى كل بئر عن طريق هز اللوحة برفق، ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 90 دقيقة. هذه هي لوحة المقايسة. وأثناء التحضين، قم بإزالة الغطاء من لوحة معقمة ذات 24 بئراً وضع قطعة من ورق الترشيح بمقاس 2 cm × 2 cm في قاع كل بئر. بعد ذلك، قم بتغطية اللوحة بقطعة من ورق البارام بمقاس 4 inches × 7 inches باستخدام جسم مستطيل كبير مثل علبة رؤوس الماصات الدقيقة.

افرك البارافورم على الآبار لثقبه عند فتحات الآبار وإنشاء سدادة فوق بقية الطبق. ثم قم بإزالة الدوائر المثقبة من البارافورم. والآن، وقبل 10 دقائق من نهاية فترة التحضين، أضف 200 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز ثلاثي إلى كل بئر من طبق ورق الترشيح، مع التأكد من امتصاص ورق الترشيح لكل السائل.

في نهاية فترة التحضين، قم بالتجميد السريع لصفيحة المقايسة في النيتروجين السائل. بعد ذلك، أضف 100 µL من حمض البيركلوريك بتركيز 70% إلى كل بئر من آبار صفيحة المقايسة. قم بالتغطية فوراً بصفيحة من ورق الترشيح وضع الصفائح على هزاز مداري.

رجّ الأطباق بسرعة مدارية تبلغ 80 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بقياس كسر ثاني أكسيد الكربون عن طريق نقل مربعات ورق الترشيح إلى 4 mL من سائل الوميض السائل في قوارير وميض، وقم بقياس إشارة C 14 باستخدام عداد الوميض لقياس المواد القابلة للذوبان في الحمض. انقل 400 µL من الوسط إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 mL، ثم قم بالطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق، وبعد ذلك أضف 100 µL من الطافي الناتج إلى 500 µL من خليط من الكلوروفورم والميثانول بنسبة اثنين إلى واحد.

قم برج المزيج بجهاز vortext لفترة وجيزة، ثم أضف 250 µL من الماء إلى المزيج ورجّه مجدداً. بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً لمدة 10 دقائق عند 1000 ×g. ثم انقل 200 µL من الطور العلوي إلى 4 mL من سائل الوميض السائل في قارورة وميض، وقم بقياس إشارة C 14 بعد تجويع الخلايا من المصل. قم بنقل الخلايا إلى وسط تكوين الدهون.

أضف أي مركبات مراد اختبارها، ثم قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة Celsius و 5% carbon dioxide لمدة ساعتين. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS قبل تحليل الخلايا بإضافة 120 microliters من hydrochloric acid بتركيز 0.1 normal. في كل بئر، قم بكشط الآبار لتحرير المستخلص، ثم انقل 100 microliters من المستخلص بواسطة الماصة إلى أنبوب micro fuge سعة 1.5 milliliter.

بعد ذلك، أضف 500 µL من خليط من الكلوروفورم والميثانول بنسبة اثنين إلى واحد إلى كل أنبوب. قم بالرج بجهاز الفورتيكس لفترة وجيزة، ثم احضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضن، أضف 250 µL من الماء وقم بالرج بجهاز الفورتيكس، ثم احضن العينة لمدة خمس دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، يتم طرد العينات مركزياً لمدة 10 دقائق عند 3000 Gs. انقل بعناية الطور السفلي من السائل المفصول إلى أربعة ملليلتر من سائل الومضان السائل في قارورة ومضان، ثم قم بقياس نشاط التريتيوم باستخدام عداد ومضان. ينتج عن هذا الإجراء عادةً عزل من 10 إلى 30 مليون خلية كبدية لكل فأر. وبعد الحضن طوال الليل، تظهر الخلايا السليمة بشكل سداسي، ويكون الكثير منها يحتوي على نواة.

غالبًا ما تحتوي المزارع غير الصحية على تحببات أو بثور، وهي مؤشرات على موت الخلايا. تظهر هنا نتائج مقايسة أكسدة الأحماض الدهنية حيث تمت مقارنة إضافة محفز التنفس الخلوي F-C-C-P-A ومثبط التنفس oligomycin مع ضابط مركبة لقياس الأكسدة الكاملة. يتم حساب نسبة ثاني أكسيد الكربون إلى المواد القابلة للذوبان في الحمض.

ستعمل المواد التي تعزز التنفس الخلوي مثل FCCP على إزاحة هذه النسبة نحو ثاني أكسيد الكربون، مما يشير إلى زيادة الأكسدة عبر دورة حمض السيتريك (TCA). أما مثبطات السلسلة التنفسية فستؤدي إلى تقليل الأكسدة بشكل عام عند قياسها. وبالنسبة لمركبات نشاط الـ lipo، فإن المواد التي تعزز أكسدة الأحماض الدهنية مثل FCCP أو التي تقلل من تخليق TP، مثل oligomycin، ستؤدي إلى خفض نشاط الـ lipo في الخلايا الكبدية المستزرعة مقارنة بمجموعات التحكم التي تلقت المذيب فقط. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من حدوث التروية بشكل كامل وفي الوقت المناسب بعد تضحية الحيوان.

بالإضافة إلى ذلك، أثناء مقايسة أكسدة الأحماض الدهنية، يعد التجميد الكامل للوسط أمرًا بالغ الأهمية للحصول على قياسات قابلة للتكرار لغاز ثاني أكسيد الكربون. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الكبدية الأولية، وكذلك كيفية استخدام هذه الخلايا لتحليل أكسدة الأحماض الدهنية وتخليق الدهون في المختبر (in vitro).