تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم استقلاب الأحماض الدهنية في خلايا الكبد الأولية في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعطير أولا ، كبد الفأر مع الهضم ، والوسط ، وإزالته ، ثم عزل خلايا الكبد. الخطوة الثانية هي زراعة خلايا الكبد على ألواح مغلفة بالكولاجين.

بعد ذلك ، يتم علاج خلايا الكبد بالتدخلات التجريبية المراد اختبارها. الخطوة الأخيرة هي احتضان الخلايا في وجود ركيزة تسمى الراديو. في النهاية ، يتم استخدام تحليل التلألؤ السائل لإظهار آثار التدخلات الدوائية أو الجينية المختلفة على أكسدة الأحماض الدهنية أو تكوين الدهون في خلايا الكبد الأولية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في مجال التمثيل الغذائي والسكري ، بما في ذلك كيفية تأثير التدخلات الدوائية والوراثية المحددة على بيولوجيا خلايا الكبد. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لسببين. أحدهما ، من الصعب الحصول على ظروف التروية المحددة التي تؤثر على صحة خلايا الكبد ، والثاني ، القياس الكمي لثاني أكسيد الكربون المطلق.

الغاز ليس بديهيا. سيوضح هذا الإجراء توم آكي ، طالب دراسات عليا من مختبري. قم بإعداد المضخة التمعجية عن طريق وضع أحد طرفي الأنابيب المعقمة في نضح الكبد الدافئ ، والوسط ، والآخر في حاوية نفايات.

قم بتشغيل المضخة حتى يمتلئ طول الأنبوب بالكامل بالوسط. بعد التضحية بفأر ذي أهمية ، رش بطن الفأر بكمية وفيرة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم مقصا غير حاد لعمل شق في خط الوسط عبر الأدمة ، وطول البطن ، وينعكس بشكل جانبي.

قم بعمل شق مماثل في الصفاق لكشف الأحشاء باستخدام أداة حادة ، قم بإزاحة الأمعاء برفق. لفضح الأوعية الدموية البطنية ، حدد موقع الوريد الأجوف السفلي البطني وضع خياطة أسفل الأوعية الدموية البعيدة عن الوريد الكلوي ، بعيدا عن الخياطة.

ضع إبرة وقسطرة في الوريد الأجوف السفلي ودفعها إلى ما وراء الخياطة. مع بقاء الإبرة في مكانها ، اربط الخيط حول القسطرة لتثبيتها في مكانها ثم قم بإزالة الإبرة بعناية. إذا تم القيام به بشكل صحيح ، فسوف يتدفق الدم عبر القسطرة باستخدام ماصة.

املأ المنطقة المتبقية في القسطرة بوسط التروية وتأكد من عدم وجود هواء. ثم بعناية فائقة ، قم بتوصيل الأنبوب بالقسطرة. بعد ذلك ، قم بثقب الحجاب الحاجز بعناية بمقص طرف حاد وقم بعمل شق جانبي لفضح التجويف الجنبي.

مع الحرص على تجنب المرارة والأوعية الدموية الجنبية ، ضع مشبك البلدغ حول الوريد الأجوف السفلي الصدري القريب من الوريد الكبدي. ثم قم بقص الوريد البابي وقم بتشغيل المضخة بسرعة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر في الدقيقة. قم بتنقية الكبد بوسط تروية الكبد لمدة خمس دقائق باستخدام حوالي 20 مل من وسط التروية.

خلال هذا الوقت ، لاحظ التغير الفوري في لون الكبد من اللون الأحمر إلى اللون الرمادي. إذا ظلت أجزاء من الكبد حمراء ، فإن هذا يشير إلى ضعف التروية وتقل احتمالية العزلة الناجحة بشكل كبير. بعد خمس دقائق من التروية ، أوقف المضخة وانقل الأنبوب إلى وسط هضم الكبد.

أعد تشغيل المضخة وقم ببث الكبد لمدة 10 إلى 15 دقيقة أخرى. بسرعة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر في الدقيقة حتى يتم استنفاد الوسط. في نهاية التروية ، أوقف المضخة.

يجب أن يكون للكبد لون وردي ويبدو متضخما إلى حد ما. في هذه المرحلة ، استئصال الكبد عن طريق التشريح الدقيق. انقله إلى طبق زراعة الأنسجة بطول 10 سم وقم بإزالة المرارة.

بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من وسط الطلاء إلى الكبد ، وابدأ في كشط الكبد برفق باستخدام مشرط. لإزالة خلايا الكبد ، قم بتصفية التعليق بمصفاة خلية 100 ميكرون ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل اللوحة ب 10 مل إضافية من وسط الطلاء واسحب السائل في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

ثم تكوير الخلايا عند أربع درجات مئوية ، والترميز لمدة خمس دقائق عند 350 Gs ، قم بشفط الوسط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من وسط الطلاء. بعد ذلك ، أضف 10 مل من السيليكا الغروية بنسبة 90٪ المطلية بالبولي فينيل بيرون الممزوج برفق ، ثم قم بتكبيل الخلايا كما كان من قبل. بعد الطرد المركزي ، استنشق طبقة الخلايا الميتة العائمة على الجزء العلوي من الخليط.

ثم اغسل الخلايا الحية الحية مرتين ب 20 مل من الطلاء. إعادة التركيب المتوسطة. قم بتعليق حبيبات الخلية النهائية في 10 ملليلتر من وسط الطلاء وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي ضع 90،000 خلية لكل بئر في الكولاجين المطلي 24 أطباق ثقافة الآبار تحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين ، 16 إلى 20 ساعة قبل بدء الفحص.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الدافئ وقم بتغيير الخلايا إلى تجويع مصل خال من المصل. متوسط مع 20 نانومول من الجلوكاجون. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في صباح يوم الفحص.

قم بإعداد وسط ما قبل الحضانة ثم قم بتغيير تجويع المصل. متوسط لوسط ما قبل الحضانة. احتضان الخلايا في هذا الخليط عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين أثناء الحضانة.

جفف 0.5 ميكرو كوري لكل بئر من C 14 palmitate عن طريق تبخير مذيب الإيثانول تحت النيتروجين قبل حوالي 15 دقيقة من نهاية الحضانة ، قم بإعادة تعليق بالميتات C 14 عند 12.5 ميكرولتر لكل كوري صغير في 0.1. يحتضن هيدروكسيد الصوديوم العادي الخليط عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أضف ثلاثة أحجام من الحضانة المسبقة الدافئة ، متوسطة ، واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

قم برفع كل بئر ب 25 ميكرولترا من مزيج بالميتات المخفف C 14 عن طريق هز اللوحة برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. هذه هي لوحة الفحص أثناء الحضانة ، قم بإزالة الغطاء من صفيحة معقمة 24 بئر وضع قطعة واحدة من ورق الترشيح بحجم سنتيمترين في سنتيمترين في قاع كل بئر. ثم قم بتراكب اللوحة بقطعة من المعلمة بقياس أربع بوصات في سبع بوصات باستخدام جسم مستطيل كبير مثل صندوق طرف الماصة الصغيرة.

افركي الطفيلي على الآبار لتثقيب الطفيلي عند فتحات البئر وإنشاء ختم على ما تبقى من اللوحة. ثم قم بإزالة الدوائر المثقبة من العطر. الآن قم بتغطية الآبار قبل 10 دقائق من نهاية الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من ثلاثة هيدروكسيد الصوديوم العادي إلى كل بئر من لوحة ورق الترشيح ، مع التأكد من أن ورق الترشيح يمتص كل السائل.

في نهاية الحضانة المفاجئة ، قم بتجميد لوحة الفحص في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 70٪ لكل حمض كالوريك إلى كل بئر من لوحة الفحص. قم بتغطيتها على الفور بلوحة ورق الترشيح وضع الألواح على شاكر مداري.

هز الصفائح بسرعة مدارية تبلغ 80 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثم قم بقياس جزء ثاني أكسيد الكربون عن طريق نقل مربعات ورق الترشيح إلى أربعة ملليلتر من سائل التلألؤ السائل في قوارير التلألؤ ، وقم بقياس إشارة C 14 على عداد التلألؤ لقياس المادة القابلة للذوبان في الحمض. انقل 400 ميكرولتر من الطرد المركزي المتوسط إلى جهاز طرد مركزي أنبوب fuge صغير سعة 1.5 مل بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الناتجة إلى 500 ميكرولتر من خليط اثنين إلى واحد من الكلوروفورم والميثانول.

دوامة الخليط لفترة وجيزة ثم أضف 250 ميكرولتر من الماء إلى الخليط والدوامة. مرة أخرى ، عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند الألف Gs.ثم انقل 200 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أربعة ملليلتر من سائل التلألؤ السائل في قارورة تلألؤ ، وقم بقياس إشارة C 14 بعد تجويع الخلايا في المصل. قم بتغيير الخلايا إلى وسط تكوين الدهون.

أضف أي مركبات ذات أهمية ليتم اختبارها ، ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين بعد فترة الحضانة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS قبل تحلل الخلايا بإضافة 120 ميكرولتر من 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي. لكل منها ، اكشط الآبار جيدا لتحرير المحللة ثم قم بتقطيع 100 ميكرولتر من المحللة في أنبوب فوج دقيق سعة 1.5 مل.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من خليط من اثنين إلى واحد من الكلوروفورم والميثانول إلى كل أنبوب. دوامة لفترة وجيزة ، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة عند 250 ميكرولتر من دوامة الماء ، ثم احتضان العينة لمدة خمس دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 3000 Gs.انقل بعناية المرحلة السفلية من السائل المنفصل إلى أربعة ملليلتر من سائل التلألؤ السائل في قارورة التلألؤ ، وقم بقياس نشاط التريتيوم باستخدام عداد التلألؤ. ينتج عن هذا الإجراء عادة عزل 10 إلى 30 مليون خلية كبدية لكل فأر. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، تظهر الخلايا السليمة سداسية ، وسيتم نواة العديد منها.

غالبا ما تحتوي الثقافات غير الصحية على حبيبات أو فقاعات ، والتي تدل على موت الخلايا. تظهر هنا نتائج مقايسة أكسدة الأحماض الدهنية حيث تمت مقارنة إضافة محفز التنفس الخلوي F-C-C-P-A ومثبط التنفس oligo mycin مع التحكم في السيارة لقياس الأكسدة الكاملة. يتم حساب نسبة ثاني أكسيد الكربون إلى المواد القابلة للذوبان في الحمض.

المواد التي تعزز التنفس الخلوي مثل FCCP ستحول هذه النسبة نحو ثاني أكسيد الكربون مما يشير إلى مزيد من الأكسدة عبر TC. ستقلل مثبطات دورة السلسلة التنفسية من الأكسدة بشكل عام عند قياسها. بالنسبة لمركبات نشاط الليبو ، التي تعزز أكسدة الأحماض الدهنية مثل FCCP أو تقلل من تخليق TP ، مثل oligo mycin ، ستقلل من نشاط الدهون في خلايا الكبد المستنبتة عند مقارنتها بضوابط المركبات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من حدوث الوفرة بشكل كامل وفي الوقت المناسب بعد التضحية بالحيوانات.

بالإضافة إلى ذلك ، أثناء فحص أكسدة الأحماض الدهنية ، يعد التجميد الكامل للوسط أمرا بالغ الأهمية للقياسات القابلة للتكرار لغاز ثاني أكسيد الكربون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا الكبد الأولية وكذلك استخدام هذه الخلايا لتحليل أكسدة الأحماض الدهنية وتكوين الدهون في المختبر.