TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحمض النووي الريبي المشارك في ترجمة الحمض النووي الريبي بطريقة محددة في ذبابة الفاكهة في أجنة ذبابة الفاكهة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الأجنة أولا من خط ذبابة معدلة وراثيا ، مما يسمح بالتعبير المحدد عن وحدة فرعية ريبوسومية موسومة GFP في نوع الخلية المستهدفة ، في هذه الحالة ، خلايا العضلات المترهلة. الخطوة الثانية هي توليد محللة للحصول على مستحضر متعدد الأشكال يحتوي على خليط من الريبوسومات الموسومة وغير المميزة.

بعد ذلك ، يتم تقدير تركيز البروتين في المحللة ويتم إجراء تنقية التقارب بخرز مقترن بالأجسام المضادة ل GFP لالتقاط مجمعات الحمض النووي الريبي الريبوسوم من نوع الخلية المعنية. الخطوة الأخيرة مخصصة للتريول والحمض النووي الريبي والاستخراج والتنقية. في النهاية ، يتم إجراء تقييمات الجودة والنوعية باستخدام محلل حيوي و R-T-Q-P-C-R على التوالي.

يمكن بعد ذلك استخدام الحمض النووي الريبي للتحليل الكمي العالمي عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أو المصفوفات الدقيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لطريقتنا الحالية ، مثل فرز VX ، هي أنها لا تتطلب خطوة لابو لتفكك الخلية. يمكن إجراؤه على مقاعد البدلاء.

إنه سريع ويسمح بالتعرف المباشر على الحمض النووي الريبي المترجم في عدد قليل جدا من الخلايا ، وهو فائدة قياسية لفهم اكتساب خصائص الخلية. حتى لو كانت هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتكوين العضل في جنين جوزفين ، فيمكن تطبيقها أيضا على الأنسجة الأخرى أو الكائنات الحية الحديثة ، مثل النبات أو الحمار الوحشي أو الأسماك أو الفأر ، ويمكن أن تساعد أيضا في متابعة تأثير العلاج على تخليق البروتين في حالة علم الأمراض. سيوضح الإجراء بنيامين بيرتا ، طالب دكتوراه من مختبري بعد الهندسة ، كلا الخطين المعدلين وراثيا وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول والعبور لإنشاء الخط المعدل وراثيا مزدوج المصيدة ، وتضخيم الخط عن طريق إعداد ثمانية أقفاص أسطوانية كبيرة تحتوي أولا على حوالي 40 جراما من الذباب الصغير لكل قفص ، وهو ما يعادل حوالي 180،000 ذبابة لكل قفص.

قم بإعداد أطباق بتري بقطر 11 سم تحتوي على خليط من الأجار المتصلب وعصير العنب مع تغطية ثلث السطح بمعجون الخميرة الطازج ، والسماح للذباب بوضع البيض على هذه الأطباق لمدة ساعة واحدة. كرر هذه العملية على مجموعتين أخريين من أطباق عصير العنب الطازج للسماح للذباب بإفراغ أوكتاله بالكامل. سيتم وضع الأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة المرغوبة من الصليب على اللوحة الرابعة.

قم بإزالة الصفائح التي تحتوي على الأجنة المرغوبة من الأقفاص والسماح لها بالتحتضن إلى مرحلة النمو المطلوبة في درجة حرارة الغرفة. يتم استخدام حضانة لمدة 13 ساعة هنا. ثم أعد تعليق محتوى اللوحة بحوالي 50 مل من الماء باستخدام فرشاة.

افصل الأجنة عن الذباب الميت عن طريق تمرير السائل عبر ثلاثة مناخل بأقطار 700 و 355 و 112 ميكرون. اشطف الأجنة المجمعة في أصغر غربال قطرها بالماء المتأين. قم بتغطية الأجنة في مبيض 4.5٪ في الماء المتأين لمدة دقيقتين ، ثم اشطفها جيدا بالماء المتأين لمدة 30 إلى 60 ثانية.

احتضان الأجنة في PBS 0.01٪ T بين 20 و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. Cyclo heide لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض. بعد تجفيف الأجنة على صفائح ماصة السليلوز ، انقلها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ، ثم قم بوزن الأنابيب وميضها ، وقم بتجميد الأجنة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الأجنة المجففة لعدة أشهر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. نقل الاتجاه 1.5 جرام من الأجنة المجففة إلى أنابيب 15 ملليلتر مبردة مسبقا ، تحتوي على أربعة ملليلتر من استخراج البولي سوم ، عازلة ومتجانسة. باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 10 ملليلتر.

ثم انشر الأجنة المتجانسة إلى أنبوبين من البرد المسبق ، وأنبوبين من المليلتر وطحن الأجنة في مطحنة حبة سريعة السرعة متعددة الاتجاهات. اضبط على التشغيل مرتين لمدة 10 ثوان عند 5,000 دورة في الدقيقة مع توقف مؤقت لمدة 15 ثانية بين كل دورة. بعد 10 دقائق من الطرد المركزي عند 2000 جم ، انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق طازج مبرد مسبقا على الجليد.

أضف 10٪ غير P 40 إلى المادة الطافية S إلى التركيز النهائي 0.1٪ واخلطها برفق عن طريق قلب الأنبوب. أضف 300 ميكرومولار من DHPC إلى تركيز نهائي يبلغ 30 مللي مولار واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. احتضن الخليط على الثلج لمدة خمس دقائق ، واخلطه عن طريق الانعكاس عدة مرات أثناء الحضانة.

بعد الحضانة في الجليد. قم بإعداد سوبينات ما بعد الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 20 ، 000 جم ، وبعد قياس تركيز البروتين بطريقة برادفورد والحصول على تركيز بروتين يتراوح بين 60 إلى 80 ملليغرام لكل مليلتر ، قم بنقل SNAT إلى أنبوب طرد مركزي دقيق طازج مبرد مسبقا وانتقل على الفور إلى خطوة الامتصاص المسبق. أعد تعليق الخرزات المغناطيسية بتحريض لطيف ثم انقل 30 ميكرولترا من الخرز لكل مليلتر من المحللة إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

اجمع الخرزات الموجودة على المغناطيس ، وانزع الماصة وأعد تعليق الخرزات و 500 ميكرولتر من مخزن استخلاص البوليسوم. بعد ذلك ، اجمع الخرز على المغناطيس. مرة أخرى ، أضف الجنين ، التحلل واحتضان لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية على المدور.

قم بإزالة الخرزات وضع العامل المستلق على الثلج حتى خطوة تنقية المناعة. مع الاحتفاظ ب 100 ميكرولتر من السوبينات كعينة الحمض النووي الريبي العالمية للمقارنة مع العينة التي تم جمعها بعد تنقية المناعة لتنقية العينة ، أضف ملليلترا واحدا من المحللة الممتصة مسبقا إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي يحتوي على 90 ميكرولترا من الخرز المسدود المقترن بالجسم المضاد GFP. احتضان العينة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها مع خلط لطيف في أنبوب دوار بعد الحضانة.

اغسل الخرزات عن طريق تدوير الخرزات المتبقية أولا في جهاز طرد مركزي صغير. ثم اجمعها على مغناطيس ، قم بإعادة تعليقها في 500 ميكرولتر من الغسيل ، والعازلة واحتضانها مرارا وتكرارا. قم بإنهاء الخلط لمدة 10 دقائق في الغرفة الباردة ومرة أخرى ، اجمع الخرزات على المغناطيس.

انقل الخرزات إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي R قبل الدرع واغسلها مرتين أخريين. أخيرا ، بعد جمع الخرزات على المغناطيس ، انتقل إلى استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة مليلتر واحد من TRIOL إلى الخرزات وإجراء الاستخراج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اتبع ذلك عن طريق تنظيف الحمض النووي الريبي ، باستخدام مجموعة RNEZ الدقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

لاختبار خصوصية الحمض النووي الريبي المحاصر ، قم بإجراء نسخ عكسي على ثلاثة نانوغرامات من الحمض النووي الريبي المناعي المنقى والمدخل وفقا للإجراءات القياسية. ثم استخدم CDNA الذي تم الحصول عليه ل QPCR مع مجموعات التمهيدي الخاصة بالجينات. تظهر هذه الصورة متحدة البؤر لجنين المرحلة 16 تعبير RPL 10 A-E-G-F-P ، وتحديدا في خلايا العضلات الست المترهلة في كل جزء من HEMI ، لوحظ تحديد موقع RPL 10 A-E-G-F-P مع علامة العضلات العامة بيتا ثلاثة توبولين.

تم تشغيل الحمض النووي الريبي المحاصر على محلل حيوي لأغراض مراقبة الجودة. لاحظ السلامة المثالية لواحد ثمانية ثانية واثنين من ثمانية ثانية من الحمض النووي الريبوزي الريبوزي. يوضح هذا الشكل نتائج تحليل RT QPCR على ثلاثة تكرارات بيولوجية من أجنة المرحلة 16 ، ويوضح الخصوصية العالية ل mRNA المعزول بالمصائد.

تم حساب تغيير FO مقارنة بالمدخلات وتطبيعه مقابل جين ريبل 32 ميث. يتم إثراء نسختين موجودتين في جميع سلالات العضلات بمقدار 2.3 ضعف مقارنة بالمدخلات ، في حين أن النصوص الأكثر تقييدا هي خلايا عصبية غنية بمقدار 5.6 أضعاف تعبر عن بروسبيرو وتنضب الجوارب والجينات 2.2 ضعفا و 5.5 ضعفا على التوالي بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين ، لا سيما في مجال علم الأحياء التنموي ، لاستكشاف الالتزام بالمساعدة الذاتية واكتساب خصائص الخلية أثناء تمايز أجنة دوف.