كوبفر عزل الخلايا للجسيمات متناهية الصغر سمية اختبار
August 18th, 2015
البلاعم الكبدية ، المسماة خلايا Kupffer ، هي المسؤولة عن التقاط الجسيمات النانوية المنتشرة. نصف هنا طريقة عالية النقاء والمحصول للخلايا لعزل خلايا كوبفر. يتم استخدام مقايسة LDH المعدلة هنا لقياس السمية التي تسببها الأنابيب النانوية الكربونية في خلايا Kupffer.
الهدف العام من التجربة التالية هو عزل وتنقية كوب الفأر للخلايا ذات العدد الكبير لدراسة سمية الجسيمات النانوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نفخ كبد الفأر بمحلول H-B-S-S-E-G-T-A والكولاجين ، وهو محلول لهضم أنسجة الكبد بلطف. بعد ذلك يتم تنقية خلايا الكبد عن طريق الكثافة والطرد المركزي والالتصاق الانتقائي للحصول على ثقافة الكوب المنقى للخلايا.
ثم يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي من أجل تأكيد النقاء والخصائص الحمضية F للكوب للخلايا. تم الحصول على النتائج التي تظهر أنه يمكن قياس سمية أنبوب نانو الكربون الوظيفي في كوب للخلايا. استنادا إلى دعم L-D-H-S-A المعدل ، يمكن تطبيق هذا النموذج على اختبار سمية الجسيمات النانوية.
يمكن أن تساعد الطريقة التي نهدف إلى إظهارها لك اليوم في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم النانوية ، مثل تقييم سمية ناقلات الأدوية المطورة حديثا ، وهذا مهم جدا لأن معظم خطوط الخلايا الخالدة المستخدمة تظهر خصائص مختلفة بشكل كبير عن الأنسجة التي اشتقت منها. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية. إذا تم تنفيذ الطريقة بنجاح ، فسيؤدي ذلك إلى الحصول على إنتاجية عالية ونقاء لخلايا ke ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك كنموذج لفحص مجموعة من الجسيمات النانوية لتلك السمية.
بعد التحضير الطازج لجميع الكواشف المدرجة في جدول المواد والكواشف الموجودة مع بروتوكول النص المصاحب ، قم بتسخين محلول E-G-T-A-H-B-S-S ومحلول الكولاجيناز عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، استخدم 70٪ من الإيثانول لشطف الأنبوب المرن للمضخة. ثم صب 40 مل من محلول E-G-T-A-H-B-S-S في أنبوب طرد مركزي مغمور في الحمام المائي واستخدم E-G-T-A-H-B-S-S الدافئ لشطف المضخة الأنابيب المرنة. بعد القتل الرحيم لقرص مضغوط ، وفقا لبروتوكول النص ، احلق شعر البطن واستخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير سطح البطن.
تأكد من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم. اقطع تجويف البطن وفضح الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي عن طريق تحريك الأمعاء بشكل جانبي إلى يسار البطن. ابدأ تشغيل المضخة بسرعة من واحد إلى ثلاثة ملليلتر في الدقيقة باستخدام محلول E-G-T-A-H-B-S-S وبإبرة فراشة قياس 23 ، قم بتدوير مشبك الوريد البابي في الجزء المقنن من الوريد البابي ثم اقلب ملقط الجيب على سطح بطن الفأر المفتوح.
يجب أن يصبح الكبد شاحبا خلال أول 30 ثانية من التروية ، وشق الجزء السفلي من الوريد الأجوف السفلي بسرعة لتجنب تراكم الضغط الزائد في الكبد وزيادة معدل التدفق تدريجيا إلى سبعة ملليلتر في الدقيقة خلال الدقيقة الأولى من التروية. عندما يبقى أقل من خمسة ملليلتر من محلول E-G-T-A-H-B-S-S في أنبوب الطرد المركزي. أضف 40 إلى 50 مل من محلول الكولاجين ، ثم قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا إلى 10 مل في الدقيقة على مدار 30 ثانية.
اجعل الكبد ينتفخ باستخدام الملقط للضغط بشكل دوري على الوريد الأجوف السفلي لمدة 10 إلى 32 فواصل زمنية سيؤدي ذلك إلى تحسين تفكك الخلايا وتقليل وقت التروية باستخدام الكولاجيناز. عندما يبقى أقل من 10 مل من محلول الكولاجيناز داخل أنبوب الطرد المركزي ، أضف 40 إلى 50 مل إضافيا من محلول الكولاجيناز الدافئ مسبقا إلى الأنبوب.
ثم بمجرد أن يتم حشو 70 إلى 80 مل ، استخدم الملقط لتطبيق ضغط خفيف على السطح. تشير علامة الاكتئاب إلى أن خلايا الكبد منفصلة. قم بإزالة الكبد من تجويف البطن على شكل قطعة واحدة ووضعه في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 20 إلى 30 مل من الكوب لعزل الخلايا. متوسط.
احتفظ بخلايا الكبد على الجليد لمدة تصل إلى ثلاث ساعات وقم بتجميع ما يصل إلى ثلاثة كبد لتنقية الكوب للخلايا. ضع كبدا واحدا منفوخا في طبق بتري مع 15 مل من الكوب لعزل الخلايا ، متوسطة مع مقص أو ملاقط. تمزق الكبسولة اللامعة وإطلاق جميع خلايا الكبد في الوسط.
قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 50 GS عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. ستكون الخلايا المتني في الحبيبات وستكون الخلايا غير المتني في المادة الطافية.
اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي نظيف وجهاز طرد مركزي بوزن 50 جم لمدة دقيقتين. كرر ما مجموعه أربع تحويلات ودورات. جهاز الطرد المركزي التالي.
السوبرنات في 1 ، 350 GS لمدة 15 دقيقة. لحبيبات الخلايا غير المتني ، تخلص من supernat وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الكوب لوسط عزل الخلية ، أضف محلول الخلية غير المتني إلى التدرج متساوي التوتر 25 50٪ المسبق المعد وفقا لبروتوكول النص وجهاز الطرد المركزي عند 850 GS لمدة 15 دقيقة دون تسارع أو انقطاع. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، استنشق حوالي 12 مل من الكوب المخصب لجزء الخلية الذي يبدو عكرا داخل جزء SIP 25٪ بالقرب من واجهة SIP 25 50٪.
انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 35 إلى 40 مل من الكوب لعزل الخلايا ، وخلط متوسط ولطيف ثم جهاز الطرد المركزي عند 1 ، 350 GS وأربع درجات مئوية لحبيبات الخلايا ، وتخلص من السوبر المسمى واستخدم خمسة إلى 10 ملليلتر من وسط التسخين لإعادة تعليق الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي. عد الخلايا واستخدم تلطيخ تريان الأزرق لقياس لوحة البقاء. الخلايا غير المتني النقية في 24 لوحة بئر بكثافة خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة الوسط برفق. استخدم HBSS الدافئ مسبقا لغسل الخلايا واستبدالها ب 500 ميكرولتر لكل بئر من الكوب الدافئ الطازج لوسط زراعة الخلايا.
أعد الخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق قبل المعالجة بجزيئات الجسيمات النانوية. بعد توصيف النقاء والنشاط البلعمي ل C للخلايا والحضانة باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية الوظيفية أو FCTS كما هو موضح في بروتوكول النص ، تخلص من المادة الطافية وأضف 200 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للتحلل. احتضان درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، وقم بإجراء سحب ماصة قوي وجمع الكوب الكذب للخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
ثم جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 GS لمدة 10 دقائق لسحب fcn ts التي تم التقاطها بواسطة الخلايا على حطام الخلية. اجمع المادة الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقم بتخزينها سالب 20 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، انقل 50 ميكرولترا إلى صفيحة 96 بئر وأضف حجما متساويا من محلول خلط الركيزة من مجموعة نازعة هيدروجين اللاكتات.
قم بتضمين ثلاث نسخ من الآبار الفارغة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من محلول التحلل المؤقت و 50 ميكرولترا من محلول مزيج الركيزة. ثم قم بتغطية الطبق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إضافة 50 ميكرولتر من محلول التوقف. أخيرا ، اقرأ الامتصاص عند 490 نانومتر في قارئ صفيحة دقيقة واستخدم الصيغة التالية لحساب النسبة المئوية لصلاحية الخلية.
يوضحهذا الشكل أن عدد الخلايا غير المتني النقية يتراوح بين ثمانية و 14 في 10 إلى الخلايا الست لكل فأر وتريان. أظهر التلوين الأزرق ما يقرب من 95٪ من صلاحية الخلية. اتخذ الكوب الملتصق للخلايا شكلا دائريا في غضون 30 دقيقة من الحضانة وبعد أربع ساعات انتشرت الخلايا وبدأت العناقيد في التكون كما هو موضح هنا.
تم تلطيخ الخلايا بجسم مضاد F four 80 لإثبات كوب لنقاء الخلية ، والذي تم قياسه فوق 95٪ عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، بعد 12 ساعة في الثقافة ، أظهر تحليل القياس الخلوي المنخفض أن 85٪ من الخلايا كانت قادرة على النشاط الحمضي PHA من خلال قدرتها على امتصاص حبات فلورية ميكرومتر واحد. ومع ذلك ، انخفض هذا الرقم عند 72 ساعة في الثقافة عندما كانت 40٪ فقط من الخلايا البلعمة الموضحة هنا.
كوب للخلايا المحتضنة بأنابيب نانوية كربونية وظيفية لمدة 24 و 72 ساعة كان له أشكال مماثلة مقارنة بالخلايا الساذجة. في الكوب على النقيض من ذلك للخلايا المحتضنة ب 10٪ DMSO المستخدم كعنصر تحكم إيجابي أظهر مورفولوجيا نخرية بعد تحليل كوب فحص LDH المعدل للخلايا المعالجة بنسبة 10٪ DMSO لمدة 24 و 72 ساعة أظهر سمية عالية بالمقارنة ، تسببت FCTS في انخفاض طفيف ولكن كبير في صلاحية الخلية فقط عندما تعرضت الخلايا ل 50 ميكروغرام لكل مليلتر لمدة 72 ساعة. باتباع هذه الطريقة ، يمكن اختبار SC الأخرى القائمة على الخلايا وجميع أنواع الجسيمات النانوية باستخدام خلايا ke المعزولة.
هذا يسمح بجمع بيانات موثوقة مع تقليل استخدام. نأمل أن تساعد هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجال علم نفس تقنية النانو لفحص سلامة العديد من ناقلات النانو الواعدة التي يتم تطويرها بشكل متزايد.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تركز هذه الدراسة على عزل وتنقية خلايا كوبر في الفأر للتحقيق في سمية النانو الجسيمات. يتم استخدام طريقة تتضمن نضح الكبد وطريق الترسيب بالكثافة لتحقيق نقاوٍ عالية للخلايا والعائد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم السموم
الخلفية
- خلايا كوبر هي خلايا ماكروفايج في الكبد تلتقط النانو الجسيمات المتداولة.
- فهم سمية النانو الجسيمات أمر بالغ الأهمية للتطبيقات الطبية الحيوية.
- تقنيات عزل الخلايا عالية النقاوة ضرورية لاختبار السمية بدقة.
- اختبار LDH المعدل هو طريقة موثوقة لتقييم سمية الخلايا.
هدف الدراسة
- لعزل وتنقية خلايا كوبر من كبد الفأر.
- لدراسة سمية أنابيب الكربون النانوية في هذه الخلايا.
- للتحقق من استخدام خلايا كوبر في اختبار سمية النانو الجسيمات.
الطرق المستخدمة
- نضح كبد الفأر بمحلول H-B-S-S-E-G-T-A.
- محلول الكولاجيناز المستخدم لهضم أنسجة الكبد بلطف.
- طريق الترسيب بالكثافة لتنقية الخلايا.
- تحليل التدفق الخلوي لتأكيد نقاوٍ الخلايا ووظيفتها.
النتائج الرئيسية
- تم الحصول على ثقافات خلايا كوبر عالية النقاوة بنجاح.
- كانت سمية أنابيب الكربون النانوية قابلة للقياس في خلايا كوبر.
- اختبار LDH المعدل قيم سمية الخلايا بشكل فعال.
- يدعم هذا النموذج المزيد من اختبارات سمية النانو الجسيمات.
الاستنتاجات
- توفر طريقة العزل أسلوبًا موثوقًا لدراسة خلايا كوبر.
- يمكن اختبار أنابيب الكربون النانوية الوظيفية للسمية في هذا النموذج.
- تسهم النتائج في فهم تفاعلات النانو الجسيمات في الكبد.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolating primary Kupffer cells addresses a key limitation in nanotoxicology where immortalized cell lines yield discrepant results, improving predictive confidence in nanoparticle safety assessment. This method supports target validation by providing a physiologically relevant model of liver macrophage function, critical for de-risking nanoparticle-based drug carriers. High-yield, high-purity isolation enables reproducible screening of nanomaterials, aligning with early discovery goals for translational biomarker alignment and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling nanoparticle-Kupffer cell interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides a purified primary cell source (>95% purity) for consistent target engagement and pathway clarification studies.
- Predictive Value: Supports lead identification by measuring functional outcomes like phagocytic activity and viability after nanoparticle exposure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized biological system for quantitative LDH-based toxicity readouts, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Uses accessible equipment (centrifuge, perfusion pump) to ensure scalability and cross-lab reproducibility.
- Assay Readiness: Generates sufficient cell yield (up to 14×10⁶ cells/mouse) for multi-well plate screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by using primary cells that reflect human liver macrophage biology more closely than immortalized lines.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through consistent toxicity measurement (e.g., LDH release) across nanoparticle doses and exposure times.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned screening where Kupffer cell activation or dysfunction predicts in vivo nanoparticle clearance and safety.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a reproducible assay for nanoparticle toxicity screening before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle uptake and macrophage activation via flow cytometry confirmation of F4/80+ phagocytic cells.
- Screening: Enables assay standardization through density gradient purification and selective adhesion steps that yield homogeneous Kupffer cell populations.
- Analytics: Generates quantitative viability data via modified LDH assay, allowing dose-response modeling and cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RES-mediated nanoparticle capture, a key determinant of biodistribution and clearance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable to diverse nanomaterials (e.g., functionalized CNTs, drug carriers) across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using primary cells that maintain native phagocytic and cytokine signaling functions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized perfusion, digestion, and purification steps yielding >95% pure Kupffer cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early predictive confidence in nanoparticle biocompatibility, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanocarriers based on liver macrophage toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, perfusion techniques, and primary cell handling.
- Dependent on centrifugation equipment, cell strainers, and flow cytometry for validation.
- Necessitates standardization across teams for collagenase digestion times and gradient preparation to ensure consistency.
- Adaptation considerations include adjusting mouse weight (35-45 g) to optimize yield and cannulation success.
- Practical limitations include cell viability decline in culture (phagocytic activity drops from 85% to 40% over 72 hours), requiring timely assay execution.
