كوبفر عزل الخلايا للجسيمات متناهية الصغر سمية اختبار

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل وتنقية كوب الفأر للخلايا ذات العدد الكبير لدراسة سمية الجسيمات النانوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نفخ كبد الفأر بمحلول H-B-S-S-E-G-T-A والكولاجين ، وهو محلول لهضم أنسجة الكبد بلطف. بعد ذلك يتم تنقية خلايا الكبد عن طريق الكثافة والطرد المركزي والالتصاق الانتقائي للحصول على ثقافة الكوب المنقى للخلايا.

ثم يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي من أجل تأكيد النقاء والخصائص الحمضية F للكوب للخلايا. تم الحصول على النتائج التي تظهر أنه يمكن قياس سمية أنبوب نانو الكربون الوظيفي في كوب للخلايا. استنادا إلى دعم L-D-H-S-A المعدل ، يمكن تطبيق هذا النموذج على اختبار سمية الجسيمات النانوية.

يمكن أن تساعد الطريقة التي نهدف إلى إظهارها لك اليوم في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم النانوية ، مثل تقييم سمية ناقلات الأدوية المطورة حديثا ، وهذا مهم جدا لأن معظم خطوط الخلايا الخالدة المستخدمة تظهر خصائص مختلفة بشكل كبير عن الأنسجة التي اشتقت منها. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية. إذا تم تنفيذ الطريقة بنجاح ، فسيؤدي ذلك إلى الحصول على إنتاجية عالية ونقاء لخلايا ke ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك كنموذج لفحص مجموعة من الجسيمات النانوية لتلك السمية.

بعد التحضير الطازج لجميع الكواشف المدرجة في جدول المواد والكواشف الموجودة مع بروتوكول النص المصاحب ، قم بتسخين محلول E-G-T-A-H-B-S-S ومحلول الكولاجيناز عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، استخدم 70٪ من الإيثانول لشطف الأنبوب المرن للمضخة. ثم صب 40 مل من محلول E-G-T-A-H-B-S-S في أنبوب طرد مركزي مغمور في الحمام المائي واستخدم E-G-T-A-H-B-S-S الدافئ لشطف المضخة الأنابيب المرنة. بعد القتل الرحيم لقرص مضغوط ، وفقا لبروتوكول النص ، احلق شعر البطن واستخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير سطح البطن.

تأكد من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم. اقطع تجويف البطن وفضح الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي عن طريق تحريك الأمعاء بشكل جانبي إلى يسار البطن. ابدأ تشغيل المضخة بسرعة من واحد إلى ثلاثة ملليلتر في الدقيقة باستخدام محلول E-G-T-A-H-B-S-S وبإبرة فراشة قياس 23 ، قم بتدوير مشبك الوريد البابي في الجزء المقنن من الوريد البابي ثم اقلب ملقط الجيب على سطح بطن الفأر المفتوح.

يجب أن يصبح الكبد شاحبا خلال أول 30 ثانية من التروية ، وشق الجزء السفلي من الوريد الأجوف السفلي بسرعة لتجنب تراكم الضغط الزائد في الكبد وزيادة معدل التدفق تدريجيا إلى سبعة ملليلتر في الدقيقة خلال الدقيقة الأولى من التروية. عندما يبقى أقل من خمسة ملليلتر من محلول E-G-T-A-H-B-S-S في أنبوب الطرد المركزي. أضف 40 إلى 50 مل من محلول الكولاجين ، ثم قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا إلى 10 مل في الدقيقة على مدار 30 ثانية.

اجعل الكبد ينتفخ باستخدام الملقط للضغط بشكل دوري على الوريد الأجوف السفلي لمدة 10 إلى 32 فواصل زمنية سيؤدي ذلك إلى تحسين تفكك الخلايا وتقليل وقت التروية باستخدام الكولاجيناز. عندما يبقى أقل من 10 مل من محلول الكولاجيناز داخل أنبوب الطرد المركزي ، أضف 40 إلى 50 مل إضافيا من محلول الكولاجيناز الدافئ مسبقا إلى الأنبوب.

ثم بمجرد أن يتم حشو 70 إلى 80 مل ، استخدم الملقط لتطبيق ضغط خفيف على السطح. تشير علامة الاكتئاب إلى أن خلايا الكبد منفصلة. قم بإزالة الكبد من تجويف البطن على شكل قطعة واحدة ووضعه في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 20 إلى 30 مل من الكوب لعزل الخلايا. متوسط.

احتفظ بخلايا الكبد على الجليد لمدة تصل إلى ثلاث ساعات وقم بتجميع ما يصل إلى ثلاثة كبد لتنقية الكوب للخلايا. ضع كبدا واحدا منفوخا في طبق بتري مع 15 مل من الكوب لعزل الخلايا ، متوسطة مع مقص أو ملاقط. تمزق الكبسولة اللامعة وإطلاق جميع خلايا الكبد في الوسط.

قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 50 GS عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. ستكون الخلايا المتني في الحبيبات وستكون الخلايا غير المتني في المادة الطافية.

اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي نظيف وجهاز طرد مركزي بوزن 50 جم لمدة دقيقتين. كرر ما مجموعه أربع تحويلات ودورات. جهاز الطرد المركزي التالي.

السوبرنات في 1 ، 350 GS لمدة 15 دقيقة. لحبيبات الخلايا غير المتني ، تخلص من supernat وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الكوب لوسط عزل الخلية ، أضف محلول الخلية غير المتني إلى التدرج متساوي التوتر 25 50٪ المسبق المعد وفقا لبروتوكول النص وجهاز الطرد المركزي عند 850 GS لمدة 15 دقيقة دون تسارع أو انقطاع. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، استنشق حوالي 12 مل من الكوب المخصب لجزء الخلية الذي يبدو عكرا داخل جزء SIP 25٪ بالقرب من واجهة SIP 25 50٪.

انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 35 إلى 40 مل من الكوب لعزل الخلايا ، وخلط متوسط ولطيف ثم جهاز الطرد المركزي عند 1 ، 350 GS وأربع درجات مئوية لحبيبات الخلايا ، وتخلص من السوبر المسمى واستخدم خمسة إلى 10 ملليلتر من وسط التسخين لإعادة تعليق الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي. عد الخلايا واستخدم تلطيخ تريان الأزرق لقياس لوحة البقاء. الخلايا غير المتني النقية في 24 لوحة بئر بكثافة خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة الوسط برفق. استخدم HBSS الدافئ مسبقا لغسل الخلايا واستبدالها ب 500 ميكرولتر لكل بئر من الكوب الدافئ الطازج لوسط زراعة الخلايا.

أعد الخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق قبل المعالجة بجزيئات الجسيمات النانوية. بعد توصيف النقاء والنشاط البلعمي ل C للخلايا والحضانة باستخدام الأنابيب النانوية الكربونية الوظيفية أو FCTS كما هو موضح في بروتوكول النص ، تخلص من المادة الطافية وأضف 200 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للتحلل. احتضان درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، وقم بإجراء سحب ماصة قوي وجمع الكوب الكذب للخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 GS لمدة 10 دقائق لسحب fcn ts التي تم التقاطها بواسطة الخلايا على حطام الخلية. اجمع المادة الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقم بتخزينها سالب 20 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، انقل 50 ميكرولترا إلى صفيحة 96 بئر وأضف حجما متساويا من محلول خلط الركيزة من مجموعة نازعة هيدروجين اللاكتات.

قم بتضمين ثلاث نسخ من الآبار الفارغة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من محلول التحلل المؤقت و 50 ميكرولترا من محلول مزيج الركيزة. ثم قم بتغطية الطبق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إضافة 50 ميكرولتر من محلول التوقف. أخيرا ، اقرأ الامتصاص عند 490 نانومتر في قارئ صفيحة دقيقة واستخدم الصيغة التالية لحساب النسبة المئوية لصلاحية الخلية.

هذا الشكل أن عدد الخلايا غير المتني النقية يتراوح بين ثمانية و 14 في 10 إلى الخلايا الست لكل فأر وتريان. أظهر التلوين الأزرق ما يقرب من 95٪ من صلاحية الخلية. اتخذ الكوب الملتصق للخلايا شكلا دائريا في غضون 30 دقيقة من الحضانة وبعد أربع ساعات انتشرت الخلايا وبدأت العناقيد في التكون كما هو موضح هنا.

تم تلطيخ الخلايا بجسم مضاد F four 80 لإثبات كوب لنقاء الخلية ، والذي تم قياسه فوق 95٪ عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، بعد 12 ساعة في الثقافة ، أظهر تحليل القياس الخلوي المنخفض أن 85٪ من الخلايا كانت قادرة على النشاط الحمضي PHA من خلال قدرتها على امتصاص حبات فلورية ميكرومتر واحد. ومع ذلك ، انخفض هذا الرقم عند 72 ساعة في الثقافة عندما كانت 40٪ فقط من الخلايا البلعمة الموضحة هنا.

كوب للخلايا المحتضنة بأنابيب نانوية كربونية وظيفية لمدة 24 و 72 ساعة كان له أشكال مماثلة مقارنة بالخلايا الساذجة. في الكوب على النقيض من ذلك للخلايا المحتضنة ب 10٪ DMSO المستخدم كعنصر تحكم إيجابي أظهر مورفولوجيا نخرية بعد تحليل كوب فحص LDH المعدل للخلايا المعالجة بنسبة 10٪ DMSO لمدة 24 و 72 ساعة أظهر سمية عالية بالمقارنة ، تسببت FCTS في انخفاض طفيف ولكن كبير في صلاحية الخلية فقط عندما تعرضت الخلايا ل 50 ميكروغرام لكل مليلتر لمدة 72 ساعة. باتباع هذه الطريقة ، يمكن اختبار SC الأخرى القائمة على الخلايا وجميع أنواع الجسيمات النانوية باستخدام خلايا ke المعزولة.

هذا يسمح بجمع بيانات موثوقة مع تقليل استخدام. نأمل أن تساعد هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجال علم نفس تقنية النانو لفحص سلامة العديد من ناقلات النانو الواعدة التي يتم تطويرها بشكل متزايد.