القوارض الدماغ Microinjection لدراسة ركائز الجزيئي للسلوك الدوافع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع قنية وحقنات دقيقة بدقة بالإضافة إلى إجراء الحقن المجهري بشكل صحيح. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع قنية أولا بطول مناسب. الخطوة الثانية هي قطع وتجميع الحقن الصغير.

بعد ذلك ، قم بإعداد الحقن الدقيق والأنابيب ومضخة للحقن المجهري. الخطوة الأخيرة هي إكمال الحقن المجهري والسماح بمرور فترة الانتشار. في النهاية ، يتم استخدام الحقن المجهري لحقن الكواشف بدقة في منطقة الدماغ المرغوبة مما يدل على التعامل السليم.

أثناء الحقن المجهري سيكون ريان بولندا ، طالب في مختبري. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب توخي الحذر بشكل خاص وتتطلب جميع الخطوات اهتماما كبيرا من أجل ضمان وضع القنية المناسبة وموقع الحقن المجهري. لتحضير القنية أولا ، ارسم خطا مرجعيا مقاس 15 ملم على الشريط باستخدام قلم ذو رأس ناعم.

ثم استخدمه كدليل لتمييز الأقسام التي يبلغ طولها 15 ملم بالتتابع على الأنبوب بعلامة دائمة حادة. بعد ذلك ، قم بشق أنبوب القنية عن طريق لمسه على قرص القطع البطيء للأداة الدوارة. عند النقاط المحددة ، قم بتدوير القنية 180 درجة وقم بشق الجانب الآخر من الأنبوب.

لا تقطع الأنبوب تماما لأنه قد يؤدي إلى الانسداد. بعد ذلك ، قم بثني الأنبوب بحدة من أجل تقسيمه إلى أقسام 15 ملم. ثم أمسك كل طرف من طرفي القنية بشكل عمودي على قرص القطع بين الإبهام والسبابة.

قم بتدوير أنبوب القنية أثناء لمس طرفه على سطح قرص القطع لتوليد طرف غير حاد. بعد ذلك ، قم بربط طرفي القنية بإبرة مشطوفة قياس 26 للتأكد من إزالة جميع النتوءات وأن القنية خالية من العوائق. لتحضير المشبك السدادة قنية واحدة بنصف طول تقريبا مع مرقئ مستقيم متوسط الوزن ، ضع الهيموسات المقفلة على المقعد بحيث تكون القنية عمودية على المقعد

ثم قم بتغذية أحد طرفي سلك المحرك في القنية حتى يصل إلى المقعد. ثني السلك عن طريق الضغط بالأصابع حتى يتم تحقيق زاوية 30 درجة مع الحفاظ على الاتصال بين السدادة والمقعد. بعد ذلك ، قم بإزالة السلك من القنية وقطع الجزء الزائد عند 2.5 ملم من الانحناء باستخدام قواطع قطرية صغيرة.

في هذا الإجراء ، أمسك أحد طرفي أنبوب الحاقن الدقيق بشكل عمودي باستخدام مرقئ مستقيم مغلق. قم بلف الإرقاء مع الحفاظ على التوتر على الأنبوب ولفه بإحكام حول المرقئ مرة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بقياس 32 ملم من الطرف الفضفاض المقابل لأنبوب الحاقن الصغير وأمسك هذه النقطة بشكل عمودي باستخدام مرقئ ثان.

ثني الأنبوب ذهابا وإيابا مع الحفاظ على التوتر حتى ينكسر. ثم افحص أنبوب الحاقن الصغير للتأكد من أن كلا الطرفين مستقيمان وأن القطر الداخلي غير عائق. ارسم خطا مرجعيا بطول خمسة ملليمترات على شريط القياس وقم بتمييز أقسام خمسة ملليمترات من أنابيب القنية بالتتابع باستخدام علامة دائمة.

بعد ذلك ، المس أنبوب القنية بقرص القطع البطيء عند الدوران عند نقاط محددة من أجل شق الأنبوب. ثم قم بثني أنبوب طوق الحاقن الصغير بشكل حاد من أجل تقسيمه إلى أقسام بطول خمسة ملليمترات. حرك طوقا واحدا على كل أنبوب حاقن دقيق على بعد حوالي سنتيمترين من النهاية.

ضع كمية صغيرة من الغراء الفائق على أنبوب الحاقن الصغير على بعد خمسة ملليمترات من طرف واحد. بعد ذلك ، حرك الطوق فوق حبة الغراء الفائقة بحيث تكون على بعد ملليمتر واحد من نهاية أنبوب الحقن المجهري. بعد ذلك قم بتغطية طرفي ذوي الياقات البيضاء بالغراء.

ثم قم بتوصيل إبرة قياس 26 بحقنة ملليلتر واحدة مملوءة بالماء المعقم. وحرك القطعة التي يبلغ طولها ثمانية سنتيمترات من الأنابيب البلاستيكية ذات الحاقن الصغير على الإبرة ، مع التأكد من عدم ثقب الأنبوب بعد ذلك ، حرك الطرف الآخر من الأنبوب البلاستيكي فوق طرف طوق الحاقن الدقيق المجفف. ادفع مكبس الحقنة المملوءة بالماء لاختبار براءة الاختراع C.In هذه الخطوة ، وثني الحاقن الصغير المكتمل على بعد 15 ملم من النهاية المقابلة للياقة بمقدار 95 درجة.

بعد ذلك ، قم بقص الأنبوب البلاستيكي إلى 70 سم وحركه فوق طوق الحاقن الصغير. لتحضير المضخة للحقن المجهري ، اضبط قطر معدل التسريب المطلوب لإبرة الحقن المجهري وحجم الحقن المستهدف على الأنبوب. ثم اضبط وضع المضخة على مستوى الصوت بحيث يتم تسليم مستوى صوت دقيق تلقائيا.

بعد ذلك ، اضبط مسند المضخة للسماح بملء المحقنة بحجم الحقن بالإضافة إلى 0.2 ميكرولتر إضافي. الآن ضع طرف المحقنة الضيقة في الماء المعقم الموجود في قارب مصل اللبن الصغير ورفرفة المكبس برفق لتليين السلك الداخلي بالتساوي. اسحب المكبس إلى الدعامة على المضخة لملء إبرة الحقن الدقيق بالماء.

الشريحة التالية. أنبوب PE 20 المتصل بالحاقن الصغير على إبرة قياس 26 متصلة بحقنة مملوءة بالماء المعقم سعة ملليلتر واحد. رش الماء المعقم من خلال الحاقن الصغير وافحص نمط الرش والمسافة.

ثم ضع حاقن دقيق معقم في حقل معقم. حرك الأنبوب من الإبرة ، واقطع الأنبوب أسفل المنطقة التي تضررت من الإبرة مع إبقائه في وضع مستقيم لمنع الماء من التنقيط. بعد ذلك ، ادفع مكبس حقنة الحاقن الصغير للأمام قليلا لإنشاء قطرة في نهاية الإبرة وحرك أنبوب PE 20 المملوء بالماء على الإبرة.

بعد ذلك ، ادفع المكبس للأمام تماما للتحضير لتحميل العينة والتأكد من عدم وجود أثر للإيثانول في الحاقن الصغير. تحقق من الإعداد بحثا عن التسريبات عن طريق لمس قطرة الماء التي تتكون عند طرف الحاقن الدقيق بمسح مختبري نظيف عدة مرات. ثم اسحب مكبس المحقنة للخلف 0.2 ميكرولتر لإنشاء فقاعة بين الماء المعقم وأنبوب PE 20 والمحلول المراد حقنه.

بعد ذلك ، ضع الحاقن الصغير في الكاشف المراد حقنه واسحب مكبس المحقنة ببطء إلى المسند. لتحضير للحقن ، أمسك صدر الجرذ على صدر المجريب. نظف المنطقة المحيطة بالقنية باستخدام قضيب قطني مبلل بالبيتادين.

امسح غطاء الرأس ثلاث مرات بالبيتادين ثم امسح بالإيثانول مرتين. ثم ضع الحاقن الصغير المملوء في القنية. اضغط على Start on pump Micro Pump وراقب حركة الفقاعات.

عند اكتمال الحقن ، قم بإزالة الحاقن الصغير من القنية واستبدلها بسدادة. يوضح هذا الشكل تعدي منطقة الخلايا النجمية للنواة المتكئة بواسطة فيروس محقون دقيق ، ويوضح هذا الشكل تقليل دافع الفئران للإدارة الذاتية للإيثانول عن طريق تنشيط الجين المعدل وراثيا الذي تم التعبير عنه بشكل مفرط في النواة المتكئة. أدى تنشيط مواقع الخلايا النجمية الأساسية للرهبة عن طريق الإدارة الجهازية ل CNO إلى تقليل دافع الفئران للإدارة الذاتية للإيثانول بعد الامتناع عن ممارسة الجنس مقارنة ب CNO للمركبة ، والتي لم يكن لها أي تأثير في مجموعة مدربة بنفس القدر كانت تعبر عن GFP بدلا من الرهبة التي تم إتقانها بمجرد إتقانتها.

يمكن أن تسمح هذه التقنية بأدوات الحقن المجهري المخصصة للدماغ ، ومزيد من المرونة للإجراءات التجريبية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن موقع الحقن المجهري الدقيق أمر ضروري لتحقيق التأثير المطلوب.