مرجع مرق الطريقة Microdilution لDalbavancin في المختبر حساسية اختبار من البكتيريا التي تنمو هوائيا

الهدف العام من الإجراء التالي هو تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط للدالبافانسين. استخدام طريقة التخفيف الدقيق للمرق مع التركيز على الخطوات الرئيسية الفريدة ل Dalbavancin للقيام بذلك. يتم إجراء التخفيف الوسيط والمخزون من دالبافانسين في DMSO ويتم إجراء التخفيف النهائي في الكاتيون على مرق مولر هينتون المعدل المكمل بالبوليسوربات.

يتم توزيع التخفيف في صفيحة 96 بئر ويتم تلقيحها بتعليق موحد من البكتيريا. ثم يتم تحضين الصفيحة لمدة 16 إلى 24 ساعة وفحصها لتحديد الحد الأدنى من دالبافانسين المطلوب لتثبيط نمو البكتيريا. سيضمن الالتزام بهذه الطريقة الموحدة نتائج متسقة مع كل من العزلات السريرية وكما هو موضح هنا ، فإن مراقبة الجودة تعزل Dalbavancin هو عامل مضاد للميكروبات شبه اصطناعي لجليكوببتيد ليبو تمت الموافقة عليه في مايو 2014 من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج التهابات الجلد وبنية الجلد البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات الحية موجبة الجرام.

تصف هذه الطريقة المرق القياسي ، طريقة القابلية للتخفيف الدقيق للداسين ، والتي تتضمن استخدام DMSO لتحضير محاليل المخزون في بولي سوربات 80 للتخفيف من التزام العامل بالبلاستيك العرض المرئي لهذه الطريقة مفيد. نظرا لأن خطوات تحضير محلول المخزون ولوحة الميكروفون ليست نموذجية مقارنة بمعظم العوامل المضادة للميكروبات. هذه الخطوات فريدة من نوعها لعوامل lipo Glycopeptide ومن المهم اتباعها من أجل تحقيق نتائج MIC قابلة للتكرار ودقيقة.

ستظهر الإجراء جينا فيشر ، عالمة أبحاث من مختبري. يرجى ملاحظة أنه يجب استخدام احتياطات السلامة المناسبة المتوافقة مع المستوى الثاني من السلامة البيولوجية عند تنفيذ الإجراء التالي. ابدأ بوزن الكمية المناسبة من دالبافانسين لتحضير محلول مخزون 800 ميكروغرام لكل ملليلتر.

أضف الكمية المناسبة من NEAT DMSO إلى أنبوب زجاجي أو بلاستيكي معقم ، ثم انقل المسحوق إلى الأنبوب وقم بدوامه. مقبل. باستخدام محلول مخزون DALBAVANCIN 800 ميكروغرام لكل مليلتر ، قم بإعداد 100 × تركيزات نهائية للوحة MIC كما هو موضح في الأعمدة من واحد إلى أربعة. يشار إلى هذه باسم التركيزات المتوسطة.

الحجم الإجمالي المحضر على عدد لوحات الميكروفون. أخيرا ، قم بتخفيف التركيزات الوسيطة بمقدار واحد إلى 100 في مرق مولر هينتن غير المعدل ، المعروف أيضا باسم C-A-M-H-B ، المكمل ب 0.004٪ P 80. تركيز العمل الناتج من DALBAVANCIN و P 80 هو ضعف التركيز النهائي.

نظرا لأن إضافة اللقاح سيؤدي إلى تخفيف واحد أو اثنين باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات أطراف معقمة، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من كل تخفيف من دالبافانسين في الآبار المناسبة للوحة التخفيف الدقيق المعقمة 96 بئر. يسمح تنسيق لوحة الميكروفون باختبار ثمانية عينين لكل لوحة. إذا لم يتم استخدام الألواح على الفور ، فضع غشاء بلاستيكي لإغلاقها ، ثم ضعها في أكياس بلاستيكية واحفظها في ثلاجة غير قابلة للإذابة على الأقل 60 درجة مئوية تحت الصفر حتى الحاجة إليها.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم تلقيح طبق واحد طازج. لتحضير اللقاح ، حدد عدة مستعمرات معزولة جيدا من مثقاب دم من 18 إلى 24 ساعة أو لوحة مثقاب أخرى غير انتقائية. هنا ، يتم استخدام سلالات مراقبة الجودة والسلالات القاسية EPHI.

المس الجزء العلوي من كل مستعمرة بمسحة معقمة وانقل بعضا منها إلى أنبوب يحتوي على واحد إلى خمسة ملليلتر من C-A-M-H-B أو محلول ملحي. استمر في النقل حتى تتطابق العكارة مع معيار 0.5 ماكفارلاند في غضون 15 إلى 30 دقيقة من التحضير ، وقم بتخفيف اللقاح واحد إلى 100 في C-A-M-H-B للوصول إلى تركيز نهائي من خمسة أضعاف 10 إلى CFU الخامس لكل مليلتر. النطاق المقبول هو اثنين إلى ثمانية أضعاف 10 إلى وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر.

ماصة متعددة القنوات بأطراف معقمة على الفور، انقل 50 ميكرولترا من اللقاح النهائي إلى كل بئر مناسب من لوحة الميكروفون هنا. يتم تلقيح أربعة صفوف مع كل من العزلتين ليصبح المجموع أربعة مكررات لكل عزلة. بعد ذلك ، لإجراء فحص النقاء ، استخدم ماصة لنقل واحد إلى 10 ميكرولتر من المحلول في التحكم الإيجابي في النمو إلى أجار غير انتقائي ، مثل جرب أجار الصويا من الاضمحلال مع 5٪ من دم الأغنام.

استخدم حلقة معقمة لنشر المحلول على سطح اللوحة. اقلب اللوحة 90 درجة وخطها مرة أخرى للتأكد من توزيع اللقاح بالتساوي. غطي الطبق وضعيه جانبا.

استعدادا لعدد المستعمرات ، استخدم ماصة أحادية القناة لنقل 10 ميكرولتر من المحلول في بئر التحكم في النمو إلى 10 مل من المزيج الملحي ، ثم انقل 100 ميكرولتر إلى وسط زراعي مناسب غير انتقائي ، مثل جرب toay soy agar مع 5٪ من دم الأغنام باستخدام حلقة معقمة ، ونشر المحلول على السطح الزراعي بالكامل. كرر هذه العملية مرتين في اتجاهات مختلفة لضمان التوزيع المتساوي لللقاح. بعد ذلك ، قم بتكديس ما يصل إلى أربع لوحات ميكروفون في حاوية بلاستيكية لضمان إغلاق اللوحة العلوية بإحكام بغطاء.

ثم ضع منشفة ورقية مبللة داخل الحاوية البلاستيكية وأغلقها بإحكام بالغطاء في غضون 30 دقيقة من التلقيح. احتضان لوحات الميكروفون ولوحة عد المستعمرة ولوحة فحص النقاء في حاضنة الهواء المحيط عند 35 درجة زائد أو ناقص درجتين مئويتين لمدة 16 إلى 20 ساعة. في اليوم التالي ، اقرأ الحد الأدنى للتركيز المثبط على أنه أقل تركيز يمنع تماما نمو البكتيريا في الآبار كما تكتشفه العين المجردة.

حدد عدد المستعمرات على لوحة العد المستعمرة. اضرب الرقم المحسوب في عامل التخفيف. على سبيل المثال ، 50 مستعمرة مضروبة في عامل تخفيف 10 ، 000 يساوي خمسة في 10 إلى CFU الخامس لكل مليلتر.

النطاق المقبول هو 20 إلى 80 مستعمرة ، وهو ما يعادل اثنين إلى ثمانية أضعاف 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة الخامسة لكل مل. يعد تركيز اللقاح متغيرا مهما للتحكم في اختبار الحساسية من أجل الحصول على نتائج دقيقة. أخيرا ، تحقق من لوحة النقاء.

إذا كانت جميع المستعمرات مشابهة للمستعمرات المستخدمة كلقاح ، فيمكن اعتبارها نقية. إذا كانت هناك أي مستعمرات أخرى موجودة ، فهناك احتمال وجود ملوث في لوحة MIC ويجب تكرار الاختبار. DAL قبل ، تمت مقارنة نتائج MIC بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التخفيف الزراعي كما هو موضح هنا.

ما تكون نتائج Agri MIC ل Dal bevans أعلى بمرتين إلى ثمانية أضعاف من المرق. التخفيف الجزئي ، نتائج الميكروفون. ينتج هذا الفانكومايسين على النقيض ، عن طريق طرق المرق والزراعة.

لذلك ، لا ينصح بالتخفيف الزراعي لاختبار مرق dalbavancin dalbavancin. التخفيف الدقيق MIC ، يجب أن تكون نتائج مراقبة الجودة ضمن النطاقات المتوقعة كما هو موضح هنا. كان كائن مراقبة الجودة SS ، A TCC 2 9 2 1 3 مع MIC مشروط واضح جدا يبلغ 0.06 ميكروغرام لكل مليلتر ، مؤشرا جيدا على اختلاف الطريقة.

وإذا كانت النتائج التي تم الحصول عليها خارج النطاقات المتوقعة لكائنات مراقبة الجودة أو تتجه إلى الطرف الأدنى أو المرتفع من النطاق، فهناك ما يبرر التحقق من صحة الطريقة. بالإضافة إلى التحقق من صحة الطريقة باستخدام كائنات مراقبة الجودة ، يمكن أن توفر بيانات دالبافانسين وMIC من برامج المراقبة الإقليمية لمضادات الميكروبات أساسا لنتائج MIC المتوقعة في بيئة المختبرات السريرية كما هو موضح هنا ، Dal b Anson MIC ، كانت نتائج العزلات التي تم جمعها في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية في 2011 إلى 2013 أقل من 0.25 ميكروغرام لكل مليلتر ل 99.9٪ من SIUs و 100٪ من المكورات العقدية. بناء على بيانات المراقبة هذه ، من الواضح أن نتائج الميكرووفريات في دالبافانسين للمكورات العنقودية والمكورات العقدية التي تزيد عن 0.12 ميكروغرام لكل مليلتر نادرة.

إذا شوهدت أعداد أعلى، يجب تكرار الاختبار أو إرساله إلى مختبر مرجعي للتحقق من صحته. يعد تحضير تخفيف المخزون في DMSO وإضافة P 80 إلى تخفيف المرق بتركيز 0.002٪ في بئر MIC النهائي من الخطوات الحاسمة للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار في الميكروفون الآلي كما هو الحال دائما ، ولكن بشكل خاص في هذا المجال من تطوير المقاومة البكتيرية ، تعد نتائج الحساسية الدقيقة لمضادات الميكروبات أمرا بالغ الأهمية لاختيار الطبيب للعلاج المناسب.