Photopatterning البروتينات والخلايا في وسط مائي البيئة عن طريق تيو

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء تعديل سطحي لسقالة زراعة الخلايا باستخدام النشاط التحفيزي الضوئي لثاني أكسيد التيتانيوم. ويتم تحقيق ذلك عن طريق ترسيب طبقة رقيقة من ثاني أكسيد التيتانيوم على شريحة زجاجية غطائية، ثم طلائها بـ Octadecylsilane لجعل السطح بالكامل كارهاً للماء. وكخطوة ثانية، يتم سد السطح عن طريق غمر الركيزة في وسط زراعة خلايا يحتوي على ألبومين المصل.

يمتَص السطحُ الألبومين مما يجعله غير مسموح بالتصاق الخلايا. بعد ذلك، تُنقل العينة إلى محلول مائي يحتوي على الكولاجين، ثم يُستخدم ضوء UV مُركز لإشعاع السطح. وهذا يسمح لجزيئات الكولاجين بالامتصاص بشكل انتقائي في المنطقة المعرضة للإشعاع الضوئي، مما يجعل هذه المنطقة مسموحة بالتصاق الخلايا.

يمكن تكرار هذه العملية من أجل توصيف أنماط من بروتينات أو أنواع خلايا متعددة. نوضح في هذا الفيديو كيفية تعديل المنطقة اللاصقة لخلايا PC 12 بشكل انتقائي عبر التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما أدركنا أن التحفيز الضوئي بثاني أكسيد التيتانيوم يُطبق تجارياً في نوافذ الزجاج ذاتية التنظيف التي تزيل الملوثات العضوية من السطح عند التعرض للإشعاع الضوئي، مما يثبت أن الإجراء سيتم تنفيذه بالتعاون مع طالب دراسات عليا من مختبري.

ابدأ بترقيم شرائح الغطاء باستخدام قلم كتابة ماسي بطريقة تساعد في ضمان توجيه الجانب الصحيح من العينة للأعلى. بعد ذلك، قم بتنظيف شرائح الغطاء أولاً تحت مياه مقطرة مزدوجة جارية، ثم عن طريق غمرها في محلول بيرانا لمدة 10 دقائق. وبعد مرور 10 دقائق، اشطف شرائح الغطاء ثماني مرات بمياه مقطرة مزدوجة وجففها تحت تدفق النيتروجين.

بعد ذلك، قم بتركيب هدف من أكسيد التيتانيوم في نظام الترسيب بالترذيذ بتردد راديوي، ثم ثبّت شرائح التغطية النظيفة على حامل العينات باستخدام شريط بولي أميد، وضع حامل العينات في غرفة الترسيب وقم بتفريغ الغرفة حتى يصل الضغط إلى 2.0 × 10⁻⁴ pascals. بعد ذلك، قم بإدخال غاز الأرغون في الغرفة واضبط ضغط الترسيب على 4.0 mTorr مع إبقاء الغالق مغلقاً. زد قدرة التردد الراديوي RF تدريجياً لتصل إلى 70 watts.

بعد ذلك، افتح الغالق وقم بعملية الرش المهبني (sputter) لمدة 15 دقيقة للحصول على غشاء يتراوح سمكه بين 120 و 150 نانومتر. ابدأ بتجفيف دورق زجاجي وملقط في فرن عند درجة حرارة 120 °C لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ضع شرائح التغطية في مفاعل البلازما وعالج سطح ثاني أكسيد التيتانيوم ببلازما الأكسجين لمدة خمس دقائق بقدرة 200 وات مع تدفق أكسجين بمعدل 100 standard cubic centimeters per minute لإنشاء سطح أكثر ألفة للماء.

ثم أخرج العينات واغمرها في ماء مقطر مرتين للتأكد من أن السطح فائق المحبة للماء، ثم جفف السطح جيداً تحت تدفق من النيتروجين. بعد ذلك، انقل العينات والكأس المجفف والملاقط إلى حقيبة قفازات مملوءة بالنيتروجين، وقم بتحضير محلول بتركيز 1 millimolar من Octo desal trichlorethylene المذاب في التولوين. اغمر العينة في المحلول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتكوين طبقة أحادية مرتبة ذاتياً فوق أكسيد التيتانيوم.

بعد ذلك، يتم إزالة أي جزيئات فازور عن طريق غمر العينة في التولوين، والأسيتون، والإيثانول، وأخيرًا في ماء مقطر مزدوج لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم تُشطف العينة أربع مرات بماء مقطر مزدوج نقي ويُجفف السطح تحت تدفق من النيتروجين.

عقم شرائح التغطية المطلية عن طريق غمر العينات في 70%ethanol لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اشطف العينات مرتين بماء مقطر مزدوج معقم. ثم، ضع العينة في طبق قطرُه 35 مليمتر وأضف 2 milliliters من وسط نمو PC 12.

قم بتحضين العينات لمدة ثلاث ساعات على الأقل في حضانة مزودة بمحلول منظم من CO2 عند 37 درجة مئوية، وذلك للسماح لبروتين ألبومين المصل الموجود في الوسط بالامتزاز على سطح شرائح التغطية أثناء الانتظار. جهز المجهر الفلوري المقلوب عن طريق تشغيل مصباح القوس أولاً، ثم أدخل مكعب مرشح الأشعة فوق البنفسجية (UV) وقم بتدوير العدسة الشيئية للوصول إلى العدسة ذات التكبير 20x.

قس شدة الضوء باستخدام مقياس شدة الأشعة فوق البنفسجية واحسب زمن التشعيع للحصول على جرعة مقدارها 200 joules per square centimeter. بعد ذلك، استخدم الميكرومتر المسرحي واضبط قطر المنطقة المراد تشعيعها على 200 microns عن طريق تعديل الحجاب الميداني. وبعد فترة تحضين مدتها ثلاث ساعات، أضف إلى الوسط الذي يغطي الشرائح الغطائية 200 µL من Type four collagen بتركيز 3.0 mg/mL.

بعد ذلك، انقل الطبق الذي قطره 35 مليمتر إلى منصة المجهر وقم بضبط تركيز المجهر على سطح العينة باستخدام علامات الخدش. قم بتسليط الأشعة فوق البنفسجية UV على منطقة من غطاء الشريحة بجرعة قدرها 200 joules per square centimeter. ثم استبدل الوسط بـ 2 milliliters من وسط نمو جديد يحتوي على NGF وخالٍ من Type four collagen، وأعد العينة إلى الحاضنة.

قم بحصاد خلايا PC 12 المتميزة بواسطة NGF والمستزرعة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 150 ×g لمدة أربع دقائق. بعد ذلك، اشفط السائل الطافي وأضف 1 مل من وسط النمو. أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام ماصة hemocytometer.

قم بحساب كثافة الخلايا وأضف 3.0 × 10⁵ خلية إلى طبق قطر 35 ملم يحتوي على شرائح التغطية المعدلة. قم بتحضين الطبق لمدة تتراوح من يوم إلى يومين في حاضنة 5%CO2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بعد يوم إلى يومين من الزرع على السطح المعدل XC2. استخدم المجهر للتأكد من أن الخلايا تلتصق وتنمو فقط في المنطقة المعرضة للأشعة فوق البنفسجية من شرائح التغطية.

ثم أضف 67 µL من الكولاجين من النوع الرابع إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا المستنبتة، بحيث يكون التركيز النهائي للكولاجين 100 µg/mL، مع ضبط المجهر لعمل نمذجة سطحية. ضع الطبق على منصة المجهر وقم بتوجيه منطقة التشعيع لتكون مجاورة للموقع الحالي للخلايا. قم بتشعيع غطاء الشريحة بأشعة UV بجرعة قدرها 200 J/cm².

بعد التشعيع، استبدل الوسط بآخر خالٍ من الكولاجين وأعد العينة إلى الحاضنة مع محاولة إتمام معالجة العينة الواحدة في غضون 30 دقيقة. هذه صورة مجهرية إلكترونية ماسحة للمقطع العرضي لفيلم ثاني أكسيد التيتانيوم المرسب بالترذيذ. وبناءً على الملاحظة، قُدِّر سمك الفيلم بنحو 150 nanometers.

ويُلاحظ هنا أيضًا استواء غشاء ثاني أكسيد التيتانيوم المرسب. وقد كشف المزيد من التحليل باستخدام مجهر القوة الذرية أن جذر متوسط مربع خشونة السطح بلغ 0.2 نانومتر فقط. ويمتص الكولاجين من النوع الرابع والمحلول بشكل تفضيلي في المنطقة المعرضة للأشعة فوق البنفسجية حيث يتم إزاحة الألبومينات بواسطة الليزر.

ولإثبات تعدد استخدامات هذا النهج، تم أيضاً تشكيل أنماط من بروتينات أخرى مثل fibrin باستخدام التقنية ذاتها. هنا تنمو الخلايا في المنطقة ذات النمط XC two على غطاء الشريحة، وبجوارها مباشرة في المنطقة المحددة بالخط المنقط. وقد تعرض غطاء الشريحة مؤخراً للأشعة فوق البنفسجية (UV) في الموقع two وتم طلاؤه بـ type four collagen.

على مدى الأيام الخمسة التالية، تتكاثر الخلايا وتهاجر لتغطي المنطقة المرمزة حديثاً. يمكن استخدام الإجراء المعروض هنا للتلاعب بالخلايا تحت المزرعة بشكل اختياري، ومن المحتمل نمذجة أنواع متعددة من الخلايا لإنشاء أنظمة مشتركة معقدة من المزارع الخلوية الباردة.