دراسة وظيفة البروتين ودور التعبير البروتين يتغير عن طريق التدخل الأجسام المضادة وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة وظائف البروتين ودور التعبير المتغير عن البروتين بطريقة فعالة وخاضعة للرقابة بإحكام. يتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق الأجسام المضادة لتقليل كمية البروتين الوظيفي المتاح للخلية. لتحقيق ذلك ، تقترن الأجسام المضادة بببتيد يسمى Chariot ، والذي يتوسط في مرور عبر الأغشية الخلوية.

بعد ذلك ، يتم تصوير الهياكل الخلوية ذات الأهمية وإعادة بنائها ثلاثية الأبعاد من أجل تقييم آثار العلاج. تكشف النتائج أن ببتيدات العربة مناسبة بشكل خاص لاستهداف البروتينات النووية عن طريق تداخل الأجسام المضادة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تداخل الحمض النووي الريبي في أن الأجسام المضادة التي يتم نقلها إلى الخلية فعالة على الفور ، وأن الباحث قد يتحكم بشكل صارم في درجة التداخل عن طريق ضبط جرعات الأجسام المضادة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظائف البروتين في العديد من أنواع الخلايا ، إلا أنها مثيرة للاهتمام بشكل خاص لاستهداف البروتينات في الثقافات العصبية الأولية ، والتي تكون حساسة جدا للعلاجات ولكنها تتسامح مع Chariot جيدا. أثناء التحضير ، أعد تعليق مسحوق ببتيد عربة المجفف بالتجميد في ماء معقم بمعدل ميكروغرامين لكل ميكرولتر. اضغط على الأنبوب بعناية لخلط المسحوق في المحلول.

ثم قم بإعداد حصص عمل صغيرة ، هناك حاجة إلى ميكرولترين فقط لكل تفاعل ، وقم بتخزين الحصص عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد خلايا الثدييات للتعداء عن طريق بذرها في صفيحة 24 بئرا مع نصف مليلتر من المضادات الحيوية التي تحتوي على متوسطة. عند استخدام الخلايا العصبية ، قم بزرع الخلايا فقط في الصفين المركزيين وبكثافة منخفضة.

الآبار الفارغة مفيدة لاحقا. كن سريعا. يجب ألا تخرج الخلايا العصبية المستنبتة من الحاضنة لأكثر من بضع دقائق.

حتى تصل الخلايا العصبية إلى مرحلة النمو المرغوبة ، استبدل حوالي ربع إلى نصف وسيطها مرتين في الأسبوع. يجب استخدام الثقافات غير العصبية عندما تكون الخلايا عند التقاء 50٪. يظهر الإجراء التالي لستة اختبارات وست عينات تحكم.

لكل شحنة ، قم بإعداد تخفيف من 0.1 إلى 2 ميكروغرام في 50 ميكرولتر من 1X PBS لكل عينة. يمكن استخدام المجمعات الجزيئية الكبيرة للأجسام المضادة الأولية والثانوية مسبقا كشحنة أيضا. امزج المحلول بدوامة لطيفة ، متبوعا بطرد مركزي قصير.

ثم قم بتخفيف ميكرولترين من محلول مخزون العربة في 50 ميكرولتر من PBS لكل تفاعل. استخدم أنابيب منفصلة لكل عينة من أجل منع الارتباط الذاتي للعربة. الآن ، اجمع البروتينات المحضرة في تخفيفات العربة.

امزج وقم بتدوير البروتينات المدمجة. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين مجمعات شحن العربات. تعتمد كمية ببتيد البروتين المثلى على الشحنة ونوع الخلية المستخدمة.

لذلك ، يجب تحديد هذا المبلغ تجريبيا. مقدما ، قم بتسخين بعض وسط النمو مسبقا بدون إضافات بالإضافة إلى 1X PBS الذي يحتوي على 0.5 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم إلى 37 درجة مئوية. الآن ، للبدء ، قم بتخفيف مجمعات العربات المعدة ب 100 ميكرولتر من المتوسط.

قم بإزالة الوسط من الخلايا المطلية ونقله إلى الآبار الفارغة لإعادة استخدامه. ثم اغسل الخلايا برفق باستخدام 500 ميكرولتر من محلول 1X PBS والكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم الدافئ مسبقا. ضع الوسيط الذي يحمل مجمعات العربات على الخلايا وهز اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي للمحلول.

أعد الخلايا بسرعة إلى الحاضنة وانتظر ساعة قبل ذلك. بالنسبة للخلايا العصبية ، بعد ساعة من الحضانة ، انقل الوسائط المحفوظة إلى الآبار. بالنسبة لجميع الخلايا الأخرى ، أضف المصل إلى التركيز النهائي بنسبة 10٪ الخلايا العصبية المستنبتة حساسة للغاية ، مثل التغيرات في درجة حرارة الوسائط ودرجة الحموضة.

لذلك ، يجب غسل هذه الخلايا ونقلها برفق باستخدام محاليل دافئة مسبقا وإعادتها إلى الحاضنة في أسرع وقت ممكن. استمر في الحضانة طالما دعت الحاجة ، اعتمادا على الشحنة المنقولة ونوع الخلية. بعد الحضانة ، قم بمعالجة الخلايا للتحليلات اللاحقة كالمعتاد.

بروتوكولات التثبيت ، وكذلك التصوير المباشر ، كلاهما متوافق مع هذه التقنية. باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر بعدسة 63X ، التقط صورا على مسافة حوالي 0.25 إلى 0.5 ميكرون من أجل الحصول على مداخن Z ذات تفاصيل كافية مع تجنب التبييض. تعتمد مسافة الطبقة الدقيقة على حجم الهيكل المراد إعادة بنائه ويجب تحديده بشكل فردي.

لإعادة بناء الصورة ، افتح ملفات LSM في Imaris. باستخدام هذا البرنامج ، يتم استخدام زر Escape للتبديل بين Select و Naviggate. أيضا ، يمكن تحديد كائنات متعددة عن طريق الضغط باستمرار على مفتاح التحكم.

باستخدام ضبط العرض ، انتقل إلى كل قناة واضبط التباين حتى تصل الهياكل الأكثر سطوعا إلى التشبع. لا يؤثر هذا التعديل على بناء السطح ولكنه يساعد في عتبة الصورة. إذا كان الكائن المراد إعادة إنشاؤه موجودا في ملفات مختلفة، فاستخدم الدالتين تحرير وإضافة شرائح لدمج الملفات المقابلة.

بعد ذلك ، انقر فوق أيقونة إضافة أسطح جديدة وحدد تقسيم منطقة اهتمام فقط. الآن ، اضبط هوامش مربع التحديد لتناسب الكائن محل الاهتمام. اضبط شكل وإمالة الشكل المستطيل حتى تصبح جميع الهياكل المطلوبة داخل الصندوق.

يجب ضبط التحديد في كل صورة من خلال المستوى Z. قد تتم إزالة الكائنات غير المرغوب فيها لاحقا. بعد ذلك ، حدد قناة مناسبة.

للمتابعة ، استخدم أداة العتبة لإعادة بناء هيكل الاهتمام. يجب ضبط مستوى تفاصيل مساحة السطح ، أو قطر الكرة ، ليتناسب مع الهياكل التي يتم إعادة بنائها. اعتمادا على خصائص الإشارة ، يمكن استخدام إما الشدة المطلقة أو التباين المحلي.

بشكل عام ، يعمل التباين المحلي بشكل أفضل مع الإشارات المنتشرة. نظرا لخصائص هذه الإشارة ، يتم استخدام التباين المحلي لإعادة بناء البروتين داخل النواة. على أي حال ، يجب ضبط الإعدادات بشكل منفصل لكل إشارة أو هيكل محل اهتمام.

أكمل إعادة الإعمار بالنقر فوق السهم الأخضر في أسفل الشاشة. ثم اضبط الكائن بشكل أكبر باستخدام أداة Pencil. قارن عمليات إعادة البناء بعناية بالإشارة الأصلية ، وقم بقص الأسطح وإزالتها عن طريق إمالة الصور حسب الحاجة حتى تتمكن أداة القص من خدمة الغرض منها بدقة.

الآن ، قم بقياس حجم كل سطح ومساحته وشدته عن طريق تحديد الإحصائيات والإحصائيات التفصيلية ومتوسط القيم. إذا رغبت في ذلك، يمكن إنتاج إحصائيات مرمزة بالألوان عن طريق تحديد علامة التبويب اللون للسطح المقابل وتغيير الخيار المحدد من Base إلى Statistic Coded. باستخدام أداة التقاط لقطة ، يمكن التقاط الصور للنشر.

إذا كان سيتم إعادة إنشاء العديد من الكائنات داخل نفس المنطقة، فيمكن استخدام الدالة Store Parameters لحفظ المعلومات. تم اكتشاف السيميات المعبر عنها في خلايا HEK293 على وجه التحديد بواسطة الأجسام المضادة Simiate التي تم نقلها إلى الخلايا بواسطة ببتيدات العربة. تدخل تجمعات الأجسام المضادة Simiate إلى سوما وكذلك النواة ، بعد التطبيق ، حيث يتم توطينها بشكل خاص مع FLAG-Simiate كما هو موضح بالسهام الصفراء.

بطريقة تعتمد على الجرعة ، تسببت الأجسام المضادة Simiate في موت الخلايا المبرمج الهائل في خلايا HEK293 بينما لم يكن للأجسام المضادة للتحكم أي تأثير. بالنظر إلى أن الخلايا العصبية حساسة جدا للتأثيرات السامة ، فقد تم تطبيق هذه التقنية على ثقافات الحصين الأولية حيث لم يكن هناك تأثير على جدوى الخلايا العصبية عند مقارنة الخلايا الوهمية أو غير المعالجة والمعالج بالعربة. باتباع نفس مخطط التطبيق ، شوهدت تجميعات الأجسام المضادة لخنزير غينيا Alexa568 في حوالي 83٪ من الخلايا التي حدثت فيها في سوماتا وكذلك النوى بدرجات متفاوتة.

تم دعم هذه الملاحظات بشكل أكبر من خلال تحليل ثلاثي الأبعاد ، والذي كان متسقا مع النتائج من خلايا HEK293. وبالتالي ، يمكن استخدام تقنية العربة بنجاح لنقل الخلايا العصبية الأولية المنفصلة عن الحصين. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاث إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

يستغرق التكوين المعقد للعربة والبروتين محل الاهتمام حوالي 40 دقيقة. لنقل الخلايا بهذه المجمعات ، سيستغرق الأمر 70 دقيقة وساعة إلى أربع ساعات إضافية اعتمادا على حجم وخصائص الشحنة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى من أجل تحليل وظيفة البروتين بمزيد من التفصيل ، مثل التصوير المباشر وفحوصات الحركة والتحليل والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.