الميكروية مزدوجة الماسورة والمركزة لقياس خارج الخلية ايون إشارات في أنسجة المخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن ديناميكيات الأيونات في الحيز خارج الخلوي لأنسجة الدماغ وتحليلها. ويتم قياس العابر الأيوني باستخدام أقطاب كهربائية صغرى اختيارية للأيونات، والتي يمكن تحضيرها بناءً على تصميم مزدوج الأنبوب أو تصميم مركزي. وكخطوة أولى، يتم معايرة الأقطاب الكهربائية الصغرى في حمام التجارب.

ثم يتم إدخال الأقطاب الكهربائية في شرائح حصين الفأر الحادة للتسجيل؛ ولتحفيز التحولات الأيونية خارج الخلوية، يتم توفير الناقل العصبي غلوتامات، أو أحد ناهضات الغلوتامات. يرتبط الغلوتامات بالمستقبلات الأيونية في الأشواك ما بعد التشابكية ويفتحها، مما يسمح بتدفق الصوديوم إلى داخل الخلايا وتدفق البوتاسيوم إلى خارجها. يؤدي ذلك في النهاية إلى انخفاض في تركيز الصوديوم خارج الخلية وزيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية، وهو ما يتم اكتشافه بواسطة الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات.

تُستخدم هذه الطريقة لدراسة تنظيم الأيونات خارج الخلوية والتقلبات العابرة في مستوى الحديد الناتجة عن النشاط في الدماغ. نصف هنا كيفية تحضير ومعايرة نوعين من الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات. ونوضح كيف يمكن استخدامها في شرائح أنسجة الدماغ الحادة لقياس التغيرات في مستويات البوتاسيوم أو الصوديوم خارج الخلوية استجابةً لتطبيق النواقل العصبية.

سيتم عرض هذا الإجراء بواسطة Nicole Hark وSimon من مختبري. لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز شعيرة زجاجية سيليكاتية محفورة تحتوي على فتيلة لاستخدامها في الأسطوانة الحساسة للأيونات، وأخرى لاستخدامها لاحقاً في أسطوانة المرجع. بعد ذلك، استخدم غراءً مكوناً من عنصرين أو شريطاً صغيراً من رقائق الألومنيوم لتثبيت الشعيرة الطويلة والقصيرة معاً من كلا الطرفين.

قم بتسخين الأنبوب الشعري المزدوج في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإزالة الرطوبة المتبقية. بعد ذلك، قم بتخزين الأقطاب الكهربائية في مجفف حتى وقت الاستخدام، ثم ضع الأنبوب الشعري المزدوج في مركز جهاز سحب رأسي مزود بقرص دوار. استخدم قطعة من الطباشير لمنع استطالة الأنبوب الشعري.

احتفظ بالملف برفق حتى يصبح الزجاج ليناً بما يكفي للسماح بتدوير الدوار أفقياً. قم بتدويره بمقدار 180 درجة بعد التبريد، ثم أزل الكاسر الميكانيكي. طبق بروتوكول تسخين ثانٍ لسحب الشعيرية، مما ينتج عنه شعيريتان مزدوجتان حادتان.

يجب أن يكون قطر طرف الشعيرة المزدوجة قريباً من ميكرون واحد. والآن، املأ أسطوانة المرجع حتى طرفها بالماء المقطر لمنع الاستعمار البكتيري. في الإجراء التالي، ضع الشعيرة مزدوجة الأسطوانة بحيث يكون طرفها للأعلى على حامل مُصنّع خصيصاً.

بعد ذلك، ضع هذا الحامل فوق الزجاجة ذات الفوهة الواسعة التي تحتوي على HMDS المسخن مسبقاً، واتركها للحضانة لمدة 70 دقيقة. بعد ذلك، انقل الأنبوب الشعري إلى حامل معدني. ثم ضعه في فرن مُسخن مسبقاً لمدة ساعتين لتجفيف كلا الأنبوبين بعد الاستعمار، واحفظ الأنبوب الشعري جافاً في المجفف حتى وقت الاستخدام.

في يوم التجربة، يتم تحضير القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات عن طريق ملء طرف الأسطوانة السيليكونية من اثنين إلى ثلاثة µL من المستشعر الانتقائي للأيونات. بعد ذلك، تُملأ الأسطوانة من الخلف بـ 100 mM من كلوريد الصوديوم في حال استخدام قطب كهربائي دقيق حساس للصوديوم، أو بمحلول ملحي من كلوريد البوتاسيوم بتركيز 100 mM في حال استخدام قطب كهربائي دقيق حساس للبوتاسيوم. يجب توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات هواء إضافية أثناء هذه العملية.

إذا نجحت عملية التفعيل وتم ملء المستشعر بشكل صحيح، يجب أن يظهر سطح المستشعر كسطح مقعر مرئي بوضوح مقابل مادة الملء الخلفية. بعد ذلك، املأ القناة المرجعية، ثم أدخل أسلاك الفضة المكلورة في كلا الأسطوانتين وأغلق كل أسطوانة بشمع الأسنان. في هذا الإجراء، اسحب شعيرية بطول 2 mm في الساحب الأفقي للحصول على تضيق قصير وقطر طرف يبلغ 4 µm.

قبل الاستخدام مباشرةً، املأ الشعيرة السيليكونية بـ 0.2 µL من المستشعر. ولتحضير الشعيرة الداخلية، اسحب شعيرة ذات قطر صغير للحصول على شعيرتين ذات مستدقات طويلة وأطراف حادة، ثم املأهما بمحلول ملحي من كلوريد الصوديوم بتركيز 100 mM أو كلوريد البوتاسيوم بتركيز 100 mM.

ضع الشعيرات الممتلئة بالمستشعر والممتلئة بالمحلول الملحي في خط مباشر مع بعضهما البعض فوق سدادة مصنعة خصيصاً من شرائح التغطية. أدخل الشعيرة الأصغر جزئياً داخل الشعيرة الأكبر. بعد ذلك، قم بتثبيت الشعيرات على شريحة تغطية أخرى.

باستخدام صلصال النمذجة، انقل الشعيرات إلى منصة المجهر وعاينها باستخدام تكبير 100x. وبمساعدة قضيب زجاجي مثبت على مناور مجهري، قم بتمرير الشعيرة الخارجية ببطء فوق الشعيرة الداخلية حتى تصبح المسافة بين طرفيهما خمس ميكرونات تقريباً. قم بتثبيت الطرف المفتوح للشعيرة الخارجية على الشعيرة الداخلية باستخدام شمع الأسنان ثم أدخل سلكاً فضياً.

لتحضير القطب المرجعي، اسحب شعيرة باستخدام سلك في جهاز سحب رأسي، ثم تخلص من الماصة العلوية، وافتح بعدها القابض السفلي وارفع الماصة السفلية بنحو خمسة مليمترات. أغلق القابض مرة أخرى وارفعها حتى يتم وضع طرف القطب السفلي على ارتفاع خمسة مليمترات تقريبًا فوق ملف التسخين. بعد ذلك، قم بتسخين الملف واستخدم ملقطًا لثني الطرف بزاوية 45 درجة تقريبًا إلى الجانب.

قم بثنيه مرة أخرى بزاوية تقريبية تبلغ 45- درجة لتوجيه الطرف ليكون موازيًا للمحور الرئيسي. ثم املأ أسطوانة المرجع بمحلول ملحي منظم (heaps buffered saline). أدخل سلك فضة مكلور فيها وأغلق الأسطوانة باستخدام شمع الأسنان.

في هذه الخطوة، قم بتثبيت كل من القطب الحساس للأيونات والقطب المرجعي على أجهزة التحكم الدقيقة (micro manipulators) وخفضهما داخل غرفة تجريبية يتم ترويتها بسائل CSF A. وباستخدام المجهر الستيريو، قم بتوصيل الأسلاك الفضية المكلورة بمداخل مرحلة الرأس (head stage) المقابلة للمضخم التفاضلي. ثم قم بتحديد مقاومة الأقطاب.

بعد ذلك، اضبط إشارات الجهد إلى الصفر وابدأ التسجيل من أجل المعايرة. وبعد الحصول على خط أساس مستقر، انتقل إلى المحلول الملحي الذي يحتوي على تركيزات محددة من الأيون المراد قياسه. الآن، انقل شريحة من الحصين بسمك 250 micron إلى غرفة التجربة وثبتها باستخدام شبكة.

قم بخفض القطب الكهربائي الدقيق الانتقائي للأيونات والمعاير على سطح الشريحة. ثم اخفض القطب الكهربائي بشكل أكبر لمسافة 50 microns تقريبًا داخل الطبقة الإشعاعية (stratum radiator) لمنطقة CA1. ولتطبيق محفز الناقل العصبي، املأ ماصة التطبيق بـ 0.5 millimolar من الغلوتامات.

قم بتثبيت الماصة على ميكرو-مُتلاعب (micro manipulator) وربطها بجهاز تطبيق الضغط. بعد ذلك، أنزل ماصة التطبيق في النسيج وضعها بعناية بالقرب من طرف الميكرو-إلكترود الانتقائي للأيونات. ابدأ تطبيق الضغط عند 40 millibars.

يوضح الشكل هنا التغير في جهد أسطوانات المرجع لقطب مزدوج الأسطوانة وقطب مركزي استجابةً للتغيرات في تركيز الصوديوم في الحمام. وهذه هي التغيرات في جهد جهد الصوديوم لقطب مزدوج الأسطوانة وقطب مركزي استجابةً للتغيرات في تركيز الصوديوم في الحمام. يوضح هذا الشكل المخطط نصف اللوغاريتمي لتركيز الصوديوم في الحمام مقابل جهد جهد الصوديوم لكلا القطبين.

تكشف المخططات الخطية عن ميل يبلغ حوالي 48 millivolts لكلا القطبين الكهربائيين. يوضح هذا استجابة قطب كهربائي مزدوج الفوهة وآخر مركزي لتغير سريع في الحمام، حيث تغير تركيز الصوديوم من 152 millimolar إلى 70 millimolar.

لاحظ أن زمن استجابة القطب متحد المركز أسرع بشكل ملحوظ. يوضح هذا الشكل التغير العابر في تركيز الصوديوم خارج الخلية كما تم رصده بواسطة الأقطاب مزدوجة السبطة والأقطاب متحدة المركز، حيث تم تحفيز التغيرات العابرة في جهد السبطات المرجعية وتركيز الصوديوم خارج الخلية عن طريق تروية الحمام بـ 10 millimolar من aspartate لمدة 120 ثانية كما يشير الشريط. وفي هذا الشكل، تم تحفيز التغيرات العابرة في جهد السبطات المرجعية وتركيز الصوديوم خارج الخلية عن طريق التطبيق الموضعي للضغط بـ 10 millimolar من glutamate لمدة 0.2 ثانية.

لاحظ أن زمن استجابة القطب المخروطي يكون أسرع بكثير تحت هذا الظرف. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم وضع الاعتبار بأن الصقل المناسب هو الخطوة الأساسية في الإنتاج الناجح للأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للحديد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير واستخدام هذه الأقطاب للكشف عن الحديد خارج الخلوي العابر في أنسجة الدماغ.