جيل والتحليل الكمي من نابض التردد المنخفض الموجات فوق الصوتية لتحديد سونيك حساسية غير المعالجة أو المعالجة الخلايا السرطانية

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم فعالية وقابلية تكرار استخدام الموجات فوق الصوتية النبضية ذات التردد المنخفض في إتلاف مجموعات خلايا سرطان الدم البشرية، وذلك في ظل غياب أو وجود عامل مستنفد للكوليسترول. يتم تحقيق ذلك من خلال تنظيف نظام السونكة (sonication system) وتقييم استقراره. بعد ذلك، يتم تعريض خلايا سرطان الدم البشرية للموجات فوق الصوتية في غياب ووجود مادة ميثيل بيتا سيكلوديكسترين (methyl beta cyclodextrin).

تُستخدم أجهزة عد الخلايا الآلية التالية لتقييم حيوية الخلايا وتأثيرات الموجات فوق الصوتية واستنفاد الكوليسترول. كما يتم تقييم النشاط الميتوكوندري لخلايا سرطان الدم باستخدام مقايسة XTT. وفي النهاية، تشير البيانات إلى إمكانية استخدام الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد لإتلاف الخلايا الخبيثة، وهو ما يتم تعزيزه باستخدام عامل مستنفد للكوليسترول.

يهتم مختبرنا بالعلاج باستخدام الموجات فوق الصوتية النانوية، وهي طريقة علاجية حديثة تجمع بين التأثيرات المضادة للأورام للموجات فوق الصوتية وعوامل متخصصة لتعزيز هذه التأثيرات. يهدف البروتوكول الخاص بنا إلى تقييم الحساسية الصوتية لكل من الخلايا الورمية والخلايا الطبيعية لتحديد النهج العلاجية الكيميائية الصوتية المحتملة التي تستحق مزيدًا من الاستقصاء قبل السريري. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في التعامل مع المعدات المستخدمة لتقييم استقرار النظام الصوتي، حيث قد يستغرق تعلم كيفية استخدام هذه الأجهزة بشكل مثالي بعض الوقت.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث أن إجراءات التنظيف والتثبيت المستخدمة لتقييم نظام المعالجة بالموجات فوق الصوتية ضرورية للحصول على نتائج قابلة للتكرار. قبل البدء في التجربة، استخدم الكلوروفورم ومسحة قطنية لتنظيف منطقة الربط بين البوق والمحول. بعد ذلك، ضع زيتاً خفيفاً على لولب البوق والمحول.

لإزالة أي بقايا رايش معدني أو صدأ أو تراكمات أكسدة إضافية، قم بإزالة الزيت وأي ملوثات أخرى من الوصلة باستخدام المزيد من الكلوروفورم، ثم أعد تركيب البوق في المحول. ولضبط عزم الدوران للنظام بشكل صحيح، اسحب البوق خارج الجزء السفلي من الكوب وضع مفتاحاً مسلوباً داخل إحدى الفتحات الثلاث الصغيرة الموجودة بالقرب من الجزء العلوي من المحول. الآن، ضع مفتاح عزم دوران مزوداً برأس "قدم الغراب" قياس نصف بوصة على الجزء المسلوب من البوق وأحكم الربط في اتجاه عقارب الساعة المعتاد حتى يقرأ مقياس عزم الدوران 39.99 foot pounds.

بعد الإحكام، قم بتركيب المحول والبوق مرة أخرى في الكوب وثبّت القطع على حامل حلقي في وضع عمودي، ثم أعد توصيل المحول بمصدر الطاقة، واضبط النظام على وضع الجرعات النبضية. استخدم ثانية واحدة من المعالجة بالسونيكات مع فاصل زمني قدره ثانية واحدة بين النبضات، ثم اضبط النظام على السعات المطلوبة لتقييم كثافة ووظيفة نظام sauna Fire. ابدأ بوضع مقياس التجويف على مسافة 1.5 سنتيمتر، مع التأكد من عدم وجود فقاعات عند وجه مسبار المقياس.

اقرأ شاشة مقياس التكهف للتأكد من أن النظام يعمل بالشدة المناسبة. بعد ذلك، اغمر مستشعر الهيدروفون بالكامل في قارورة عينة تحتوي على 12.5 milliliters من الماء، واستخدم حامل الحلقات لتعليق الهيدروفون. وللتأكد من استقرار خصائص شكل الموجة، قم بتوصيل الهيدروفون بمدخل أوسيلوسكوب وتأكد من وجود موجة جيبية واضحة، حيث يمكن للموجات الشاذة أن تغير تردد النظام.

لتحضير الخلايا لعملية السونيكة (sonication)، ابدأ أولاً بزراعتها بكثافة 4 × 10⁴ خلية/مل في دورق بمساحة 25 سنتيمتر مربع باستخدام وسط زراعي مُحضّر حديثاً. بعد تحديد عدد الخلايا الحية باستخدام اختبار استبعاد صبغة التريبان الأزرق (trypan blue exclusion)، يتم تحضين المزرعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون حتى تصل المزرعة إلى التركيز المطلوب. وعندما تصبح الخلايا جاهزة لعملية السونيكة، استخدم مضخة تفريغ ودورق بوخنر لإزالة الغازات من حجم معين من الماء المقطر منزوع الأيونات.

ثم استخدم الماء لملء قرن الكوب حتى مستوى 15 مليمتر فوق الجزء العلوي من القرن. قم بتشغيل النظام باستخدام مياه Degas لمدة سبع دقائق تقريبًا. بعد ذلك، انقل ثلاثة مليلتر من الخلايا إلى قارورة وميض زجاجية سعة 20 مليلتر، وثبّت القارورة في جهاز التثبيت.

بعد ذلك، قم بتثبيت جهاز التثبيت في الجزء العلوي من بوق الكوب، واستخدم آلية الانزلاق لضبط جهاز التثبيت على ارتفاع 15 مليمتر من أعلى البوق عند سطح الماء. الآن، قم بمعالجة الخلايا بالموجات فوق الصوتية باستخدام ثلاث نبضات من الموجات فوق الصوتية مدة كل منها ثانية واحدة، مع فاصل زمني قدره ثانية واحدة بين كل نبضة من النبضات عند سعة 33 و50%، ثم قم بتقييم حيوية الخلايا بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية عن طريق استبعاد صبغة triam blue. لتقييم تلف الخلايا، قم بشطف فتحة جهاز تحليل الجسيمات Z two مرتين على الأقل بمحلول ملحي متساوي التوتر.

بعد ذلك، أضف 100 µL من الخلايا التي خضعت للموجات فوق الصوتية إلى 20 mL من المحلول الملحي المتساوي التوتر، وانقل عينة الخلايا إلى حامل العداد. ثم ارفع المنصة إلى الفتحة وقم بتحليل تلف الخلايا، وحيويتها، والحطام الخلوي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. لتقييم حيوية الخلايا التي خضعت للموجات فوق الصوتية بواسطة مقايسة XTT، قم بمعالجة الخلايا بالموجات فوق الصوتية باستخدام نطاق يتراوح من واحد إلى ثلاثة.

تُطبق نبضات مدتها ثانية واحدة تفصل بينها ثانية واحدة لإحداث مجموعة من مستويات الضرر التي سيقوم طقم XTT بتقييمها، ثم تُطرد الخلايا مركزياً ويُعاد تعليق الرواسب بتركيز 1×10⁵ خلية لكل ملليلتر في وسط نمو مُحضّر حديثاً. بعد ذلك، يتم استزراع 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر ضمن أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً وقاع مسطح، وبثلاث مكررات، بما في ذلك ثلاث آبار تحكم تحتوي على 100 ميكرولتر من وسط نمو كامل فقط لقراءات الامتصاص الفارغة.

قم بحضن الخلايا لمدة 24 ساعة في صباح يوم المقايسة، وقم بتدوير حصص من كاشف XTT وكواشف التنشيط المسخنة إلى 37 درجة مئوية برفق حتى تصبح المحاليل صافية. ثم أضف 0.1 ملليلتر من كاشف التنشيط إلى 5 ملليلتر من كاشف XTT. بعد ذلك، أضف 50 ميكرولتر من محلول XTT المنشط إلى كل بئر من أطباق U 9 37 و THP one الملقحة، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا.

بعد مرور ساعتين، رُجّ الأطباق برفق لتوزيع الصبغة البرتقالية بالتساوي في الآبار الإيجابية، وقس الامتصاصية باستخدام قارئ أطباق معايرة دقيقة (microtiter plate reader) بين 450 و 500 نانومتر. وأخيراً، قس الامتصاصية لجميع آبار المقايسة مرة أخرى، بين 630 و 690 نانومتر. وكما كان متوقعاً، لوحظ تلف خلوي أكثر شمولاً في المجموعة الخلوية التي خضعت للموجات فوق الصوتية عند سعة 50% مقارنة بتلك التي خضعت لسعة 33%.

ومع ذلك، فإن سعة الـ 33% تسمح بالكشف عن المزيد من الضرر عند تطبيق العوامل. كما هو الحال في هذه التجربة التي تم فيها تقييم التأثيرات المعتمدة على الجرعة لعامل استنفاد الكوليسترول methyl beta cyclodextrin في تعزيز الحساسية فوق الصوتية لخلايا U 9 37.

على الرغم من أن الخلايا التي عولجت بـ methyl beta cyclodextrin كانت مماثلة في حيويتها للخلايا غير المعالجة، إلا أن الحيوية انخفضت بشكل ملحوظ بعد تطبيق ثلاث نبضات من الموجات فوق الصوتية بتردد 40 kilohertz ولمدة ثانية واحدة. علاوة على ذلك، يبدو أن الانخفاض في الحيوية بعد عملية السونيكيشن كان معتمداً على الجرعة، حيث أدى استخدام 5 millimolar من عامل استنفاد الكوليسترول إلى أكبر انخفاض في عدد الخلايا، تليها المعالجات بـ 1 millimolar و 0.5 millimolar من methyl beta cyclodextrin، وذلك وفقاً لتقييم مقايسة XTT. ورغم أن خلايا THP 1 بدت أكثر مقاومة للسونيكيشن قليلاً من خلايا U 937، إلا أن كلا الخطين الخلويين لسرطان الدم البشري قد تضررا بطريقة معتمدة على الجرعة.

بالإضافة إلى ذلك، أدى الجمع بين التركيزات الأعلى من ميثيل بيتا سيكلوديكسترين مع عدد أكبر من نبضات الموجات فوق الصوتية إلى تحقيق أدنى مستوى من اختزال XTT إلى مشتق برتقالي اللون سائل الزيوب لكل من خلايا U 9 37 وTHP one، مما يشير إلى انخفاض حيوية الخلايا والنشاط الميتوكوندري لكلا الخطين الخلويين. وبالتبيعة لهذا الإجراء، يمكن تقييم عوامل تحسيس صوتية أخرى، مثل العوامل الموجهة للهيكل الخلوي أو العوامل المنتجة لأنواع الأكسجين التفاعلية، لمعرفة مدى تعزيزها للحساسية الصوتية، وبذلك يتم تأسيس مناهج علاجية جديدة يمكن استقصاء فعاليتها في الدراسات قبل السريرية. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تنظيم بيانات SON المكتسبة من عدادات TC وZ two بشكل مناسب، حيث إنها توفر معلومات تفصيلية حول فعالية بروتوكول العلاج والتي قد تضيع في حال عدم التنظيم.

في حالة عدم استخدام مخطط لوجستي، فبعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية استخدام الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد بالتزامن مع المحسسات التي تزيد من النفاذية في النماذج قبل السريرية المختبرية لتقييم فائدتها العلاجية المحتملة.