بروتوكول لعزل خلايا الكبد الإنسان الابتدائية والموافق السكان الرئيسية للخلايا الكبد غير متني

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكبد والسموم وتوفر لنا الفرصة لتطوير نماذج جديدة للزراعة المشتركة في المختبر ونماذج الكبد الهندسية للأنسجة. تتمثل ميزة هذه التقنية الجديدة في عزل جميع مجموعات خلايا الكبد عن نفس المتبرع ونفس القطعة الصغيرة من أنسجة الكبد. لبدء هذا الإجراء، قم بوزن أنسجة الكبد التي تم تشريحها حديثا في ظروف السفوع وضع عينة أنسجة الكبد في غطاء تدفق الهواء الرقائقي.

ثم نظف الدم بعيدا عن سطح عينة الأنسجة. بعد ذلك ، اغسل القنيات باستخدام محلول التروية 1X واحد. استخدم غراء الأنسجة لتثبيت زيتون القنيات في الأوعية الدموية الكبيرة.

ثم اختبر التروية وتحقق من وجود تسرب في القنيات. بعد ذلك ، أغلق جميع الأوعية الدموية التي تتسرب من محلول التروية الشفاف 1X مع غراء الأنسجة. بعد ذلك ، ضع عينة أنسجة الكبد المقلنة في قمع Buchner.

بعد ذلك ، اضبط معدل تدفق المضخة التمعجية بين 7.5 و 14.6 مل في الدقيقة ، اعتمادا على عدد القنيات المستخدمة ومقاومة أنسجة الكبد. قم بتفرير الأنسجة حتى يتم التخلص من الدم بالكامل لمدة 20 دقيقة على الأقل ولمدة أقصاها 30 دقيقة. في بعض الحالات ، قد يكون من الضروري تثبيت إحدى القنيات بمشابك بلاستيكية أو زيادة الضغط الداخلي لمنطقة ما عن طريق الضغط برفق على كبسولة الكبد باستخدام ملعقة من أجل تحسين التروية.

يشير التغيير الكامل في اللون من الأحمر البني إلى البني الفاتح أو الأصفر الفاتح إلى نضح جيد. بعد ذلك ، قم بتغيير سائل التروية إلى محلول هضم يحتوي على الكولاجيناز P.ثم أعد ترتيب الإعداد لخطوة الهضم. بعد ذلك ، قم بإجراء تدفق دائري لمحلول الهضم لمدة تصل إلى 15 دقيقة.

أوقف التروية بشكل دوري وتحقق من درجة الهضم. من الضروري أن يتم إيقاف التروية بمحلول الهضم على الفور عند هضم عينة أنسجة الكبد بشكل كاف. أخرج الكبد من الجهاز عندما يصبح جاهزا وضعه في طبق زجاجي.

اشطف الجزء الخارجي من عينة المناديل بمحلول التوقف المثلج. قم بإزالة القنيات من عينة أنسجة الكبد. بعد ذلك ، استخدم مشرطا لفتح عينة أنسجة الكبد عن طريق شق منتصف المنطقة التي تم فيها ربط القنيات وتأكد من بقاء كبسولة جليسون سليمة.

اشطف الجزء الداخلي من عينة الأنسجة ثم قم بتغطية عينة الأنسجة بالكامل بمحلول التوقف. بعد ذلك ، هز الأنسجة برفق لتحرير الخلايا منه. بعد ذلك ، اجمع معلق الخلية وقم بتصفيته من خلال قمع شاش في 10 أنابيب بلاستيكية سعة 50 ملليلترا.

أضف المزيد من محلول التوقف إلى عينة أنسجة الكبد حتى يتم استهلاك الحجم النهائي البالغ 500 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ، واجمع المادة الطافية لعزل NPC لاحقا ، وقم بتجميع كريات الخلية في أنابيب بلاستيكية سعة 250 مل. بعد ذلك ، اغسل كريات الخلية باستخدام PBS.

لذلك ، الطرد المركزي تعليق الخلية. اجمع المادة الطافية ، وتجمع الكريات ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط حضانة خلايا الكبد. بعد ذلك ، حدد رقم الخلية وقابليتها للبقاء في تعليق الخلية الناتج باستخدام تلطيخ Trypan الأزرق.

لعزل خلايا الكبد غير المتني ، قم بالطرد المركزي للطافي الذي تم جمعه للقضاء على كريات الدم الحمراء وخلايا الكبد المتبقية. اجمع المواد الطافية وقم بطردها مرتين للحصول على كريات الخلية لترسيب HCS و LEC و KC جزئيا و KC المتبقي. بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في HBSS. بعد ذلك ، قم بإعداد تدرج كثافة 25٪ و 50٪ عن طريق خلط محلول تدرج الكثافة و PBS للطرد المركزي المتدرج الكثافة.

ضع محلول التدرج الكثافة 25٪ بعناية فوق طبقة محلول التدرج الكثافة 50٪. بعد ذلك ، ضع نظام التعليق NPC بعناية وببطء فوق طبقة محلول التدرج الكثافة بنسبة 25٪ لتحقيق فصل واضح لكلتا الطبقتين. الطرد المركزي تعليق الخلية على تدرج الكثافة دون انقطاع.

تقع NPC في الطور البيني بين طبقات التدرج الكثافة 25٪ و 50٪. استنشق الخلايا الميتة وحطام الخلايا من الطبقة العليا واجمع الطور البيني بعناية. بعد الطرد المركزي المزدوج ، قم بإجراء عد الخلايا ل KC وجزء MPC.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لجزء NPC بخطوة الطرد المركزي المزدوجة الموصوفة سابقا وأعد تعليق NPC في وسط بذر خلية Kupffer. قم بزرع الجزء المحتوي على KC على أوعية زراعة الخلايا البلاستيكية بكثافة خمسة في 10 إلى 5 KC لكل سنتيمتر مربع. احتضان مزارع KC لمدة 20 دقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

يجب أن يلتصق KC الأولي ببلاستيك زراعة الخلايا في غضون فترة زمنية قصيرة. بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على NPC غير الملتصق والتي تتكون بشكل أساسي من LEC و HSC. لفصل LEC عن HSC ، ابدأ بالطرد المركزي للطاف.

ثم اغسل الحبيبات باستخدام PBS. بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق الخلايا في وسط فصل الخلايا البطانية للخلية النجمية وقم بإجراء تعداد الخلايا لجميع الخلايا المتبقية. بعد ذلك ، أعد تعليق 10 ملايين خلية في مليلتر واحد من وسط فصل الخلايا البطانية للخلايا النجمية.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من محلول المنع من مجموعة MAX و 20 ميكرولترا من ميكروبيدات CD31 لوضع العلامات المناعية واحتضان التعليق الناتج لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بفصل LEC عن HSC كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة لنظام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا كحد أقصى وجمع جزء HSC. قم بإزالة LEC الإيجابي CD31 المحتجز مغناطيسيا وتعليقها في وسط زراعة الخلايا البطانية للخلية النجمية.

هنا ، تظهر هذه الصور مجموعات خلايا الكبد المعزولة المختلفة مباشرة بعد عملية العزل في عرض المجهر المرحلي المتباين. تعرض هذه المجموعة من الصور الخلايا المعزولة والمزروعة بعد 24 ساعة من الزراعة. يظهر هنا التوصيف القائم على التألق المناعي لأجزاء الخلايا المختلفة.

أظهر PHH إشارات إيجابية لعلامة خلايا الكبد CK18 بعد 24 ساعة من العزل ، وكانت KC إيجابية للعلامة CD68 بعد 24 ساعة من العزل ، وأظهر LEC إشارات إيجابية ل vimentin بعد 72 ساعة من العزل ، و HSC كانت إيجابية ل GFAP بعد 72 ساعة من العزل. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن العزل الناجح يعتمد على الهضم الأمثل لعينة أنسجة الكبد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحكم في الهضم وكيفية إجراء فصل تدرج الكثافة ، وهي الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البحث الطبي لاستكشاف وظائف وأمراض الكبد في مزارع الخلايا المختبرية التي تم إنشاؤها حديثا ونماذج الكبد الهندسية للأنسجة.