السقالات المركبة من ألياف بينية متضاعف الكتروليتي عن الإصدار التحكم وزمانيا الجزيئات الحيوية

لهندسة الأنسجة إلى تلخيص البيئة الدقيقة الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية المعقدة للمكانة الخلوية. هنا ، نعرض استخدام ألياف معقدة الإلكتروليت البينية كمنصة لإنشاء سقالات بوليمرية مركبة متعددة المكونات مع إطلاق كيميائي حيوي مستدام.

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير توصيل الجزيئات الحيوية المتحكم فيه مع التحكم المكاني لتقليد المكانة الخلوية من سقالات المركبات البوليمرية المحبة للماء أو الكارهة للماء. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء إطار عمل تضحية من البوليمرات المرغوبة أولا لتوفير الترتيب المكاني للجزيء الحيوي الذي يطلق أليافا تسمى ألياف البولي السطحية ، أو ألياف IPC. تتمثل الخطوة الثانية في دمج ألياف IPC التي تحتوي على الجزيء الحيوي المحب للماء المستهدف على إطار قرابين.

بعد ذلك ، يتم تضمين ألياف IPC على تركيبات الإطار في سقالة أكبر باستخدام ركيزة نمط دقيق كقالب صب يشتمل على إشارات طبوغرافية على الركيزة. تتمثل الخطوة الأخيرة في السماح بالاستيعاب الكامل للألياف على الإطار والبناء والتصلب للبوليمرات لإنشاء ركائز غير منقوشة أو دقيقة. في النهاية ، يمكن استخدام المقايسات القياسية لإظهار ملفات تعريف الإطلاق والنشاط الحيوي للجزيئات المستهدفة.

توفر الميزة الرئيسية لهذه التقنية طريقة أخرى موجودة مثل الكبسولة الدقيقة التي يمكن الآن دمج الجزيئات الحيوية المحبة للماء في مجموعة واسعة من سقالة البوليمر المحبة للماء أو الكارهة للماء في عملية دمج وتصنيع بسيطة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال توصيل الأدوية ، بما في ذلك التدرج الكيميائي الحيوي المنظم للإطلاق الكيميائي الحيوي المتعدد ، وهذا التأثير التآزري للإشارات الطبوغرافية والإفراز الكيميائي الحيوي المستمر على سلوك الخلية. يعد العرض المرئي لتكوين ألياف البولي إلكتروليت أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الخطوات.

يعد تركيز السرعة ونقاء محلول الإلكتروليت البولي أمرا بالغ الأهمية في التكوين المستقر لألياف IPC لبدء خلط البروتينات أو عوامل النمو أو الجزيئات الحيوية الأخرى ذات الأهمية في 10 إلى 20 ميكرولتر من محاليل الإلكتروليت المتعددة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. في المكان التالي ، قطرات صغيرة من 10 إلى 20 ميكرولتر من الشيتوزان والألجينات على سطح مستو ثابت مغطى بالشكل. يجب وضع قطرات الشيتوزان والألجينات على مقربة من بعضها البعض ، ولكن ليس على اتصال مع بعضها البعض.

اغمس أحد أطراف زوج من الملقط برفق في قطرة الرمل الورقية والطرف الآخر في قطرة الألجينات. ثم اجمع قطرات الإلكتروليتات المتعددة معا عن طريق الضغط على الملقط. عندما تتلامس القطرات مع بعضها البعض ، اسحب الملقط ببطء عموديا لسحب ألياف معقدة الإلكتروليت البولي السطحية ، والمعروفة باسم ألياف IPC من واجهة القطرتين.

ضع بعناية نهاية ألياف IPC المسحوبة على مجمع يتكون من سقالة بوليمرية مسطحة مثبتة على مغزل دوار. قم بتدوير المغزل بسرعة ثابتة تبلغ 10 ملليمترات في الثانية للسماح بتكوين ألياف IPC موحدة وأقل حبة. ستؤدي زيادة سرعة سحب ألياف IPC إلى تكوين حبات ، مما سيؤدي إلى إطلاق انفجار للكيمياء الحيوية المدمجة وإنهاء الألياف المبكرة.

بالاتفاق مع الملاحظة التي أدلى بها لياو وآخرون ، و KO et al. عندما تنتهي الألياف ، قم بتخفيف السائل المتبقي ب 500 ميكرولتر من PBS ، قم بقياس تركيز البروتين المتبقي أو محتوى عامل النمو في البقايا. من أجل تحديد كفاءة دمج الجزيئات الحيوية ، قم بوزن ثلاثة جرامات من عديد السكاريد البولندي وأضفه إلى 15 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات.

من أجل إنشاء محلول مائي بنسبة 20٪ ، قم بخلط محلول بولندا طوال الليل لضمان التجانس في اليوم التالي. صب 15 مل من محلول بولندا في طبق بوليسترين لزراعة الأنسجة بقطر 10 سم. جفف المحلول طوال الليل عند 37 درجة مئوية بمجرد أن يجف ، وقم بتقطيع الأغشية إلى سبعة ملليمترات في سبعة ملليمترات مربعة من إطارات القرابين البولندية.

بعد ذلك ، قم بإنشاء محلول 30٪ من السكريات بولندا والدكسترين في الماء المقطر منزوع الأيونات بنسبة ثلاثة إلى واحد. امزج طوال الليل لضمان التجانس ببطء ، أضف بيكربونات الصوديوم إلى محلول عديد السكاريد لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 20٪ امزج المحلول طوال الليل وقم بتخزين محلول عديد السكاريد النهائي عند أربع درجات مئوية حتى تكون هناك حاجة إليه. قم بلصق إطار بولندا القرابين في الاتجاه المطلوب على المغزل الدوار باستخدام مشبك التمساح وبعض الشريط اللاصق المطلي بالبلاستيك.

قم بتدوير المرجل بالإطار المثبت بسرعة ثابتة تبلغ 10 ملليمترات في الثانية. ثم ابدأ في رسم ألياف IPC كما هو موضح في القسم السابق. ومع ذلك ، هذه المرة ، قم بإرفاق الطرف المرسوم من ألياف IPC على إطار بولندا الدوار.

انتظر نهاية رسم ألياف IPC بعد ذلك. جفف الألياف على بناء الإطار طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، حرر الهيكل من مغزل دوار عن طريق إزالته من مشبك التمساح.

ضع الهيكل في غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير. ثم ضع خمسة جرامات من محلول بولندا دكسترين في دورق وابدأ في التقليب بسرعة 60 دورة في الدقيقة. باستخدام طبق تقليب ، أضف 500 ميكرولتر من محلول فوسفات تقليم الصوديوم بنسبة 11٪ ، و 500 ميكرولتر من 10 هيدروكسيد الصوديوم المولاري.

لربط الحل. استمر في خلط المحلول لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم اسكب محلول عديد السكاريد اللزج على الألياف الموجودة على هيكل الإطار لتضمين ألياف IPC بالكامل. احتضان الهيكل عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتشكيل سقالة مركبة متشابكة كيميائيا للحث على تكوين المسام في السقالة المركبة.

اغمر السقالة بأكملها في محلول 20٪ من حمض الأسيتيك لمدة 20 دقيقة. ثم اغسل السقالة ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق مع الرج بسرعة 100 دورة في الدقيقة. لإزالة أي كواشف غير تفاعلية متبقية ، قم بإزالة PBS الزائد وقم بتجميد السقالات المركبة على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل.

بعد ذلك ، قم بتجميد السقالات لمدة 24 ساعة على الأقل قبل استخدامها في أي فحوصات إطلاق أو نشاط حيوي خاضعة للرقابة. ابدأ بإنشاء ركيزة PDMS نقية ومنقوشة مع تضاريس مطلوبة باستخدام طرق الطباعة الحجرية الناعمة القياسية. بعد ذلك ، قم بإعداد كل من الإطار القرابيحي ل PCL لجمع ألياف IPC وقاعدة PCL المزخرفة عن طريق إذابة 0.9٪ PCL أولا في ثنائي كلورو ميثان.

لكل سنتيمتر مربع واحد من قالب صب الفيلم PDMS ، قم بإسقاط 500 ميكرولتر من محلول PCL 0.9٪ على القالب. اسمح للمذيب بالتبخر بالكامل في غطاء الدخان ، ثم كرر عملية صب 0.9٪ PCL لتكثيف الفيلم. بعد ذلك ، قم بإعداد إطار القرابين عن طريق وضع 500 ميكرولتر في كل مرة من محلول PCL 0.9٪ على ركيزة PDMS نقية منفصلة.

لإنشاء قاعدة PCL أصلية ، قم بصب طبقات متعددة من PCL للحصول على سقالة بالسماكة المطلوبة. اسمح لكل مذيب كلورو ميثان بالتبخر بالكامل في غطاء الدخان عند الوصول إلى السماكة المطلوبة. قم بإزالة فيلم PCL المجفف من ركيزة PDMS الأصلية وقم بعمل ثقب في إطار PCL باستخدام مثقاب بحجم PSAP.

بعد ذلك ، قم بتركيب إطار PCL على مغزل المجموعة وابدأ في رسم ألياف IPC على الإطار كما هو موضح سابقا. عندما ينتهي رسم ألياف IPC ، قم بإزالة الألياف الموجودة على بنية الإطار واتركها تجف طوال الليل عند 25 درجة مئوية. ضع الألياف على هيكل الإطار أعلى قاعدة PCL المزخرفة وأضف محلول PCL بنسبة 0.9٪ على الألياف على بناء الإطار عدة مرات للحصول على السماكة المطلوبة ولضمان تضمين ألياف IPC بالكامل.

أظهر ألبومين مصل الأبقار أو BSA الذي تم إطلاقه من مركب دكسترين IPD البولندي حركية شبه خطية مع إطلاق انفجار أولي موهن متبوعا بحالة مستقرة مصاحبة. بعد شهرين ، حققت BSA إصدارا إجماليا بنسبة 97٪ في المقابل ، أظهرت ألياف IPC المستقلة إطلاقا سريعا بنسبة 80٪ من BSA في غضون أربع ساعات. باستخدام نفس عامل نمو الأوعية الدموية المركب ، كان من الممكن أيضا إطلاقه بشكل مستدام من الألياف باستخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري كمنصة اختبار.

تم العثور على عامل النمو الذي تم إصداره ليكون نشطا بيولوجيا بعد إطلاقه في كل مرة. نقطة. في هذا المثال ، تم تحميل عامل نمو الأعصاب في الألياف على مدار 18 يوما. تم إطلاق ما يقرب من 80٪ من عامل نمو الأعصاب المحمل من مركب P-C-L-I-P-C في إطلاق خطي مستدام باستخدام مقايسة نمو العصبية PC 12.

كان لكمية عامل نمو الأعصاب النشط بيولوجيا التي يتم إطلاقها من السقالة وفي الوسائط في كل نقطة زمنية تأثير مماثل على نمو العصبات مثل إضافة 30 نانوغرام لكل مليلتر من عامل نمو الأعصاب إلى الوسائط العادية. قد يكون للسقالات المركبة P-C-L-I-P-C التي تحتوي على كل من التضاريس وإطلاق عامل نمو الأعصاب المتحكم فيه تأثير تآزري على السلوك الخلوي. أظهرت الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المزروعة إلى سقالات مركبة ذات نمط نانوي مستوى أعلى من التمايز العصبي مقارنة بالخلايا المعرضة للتضاريس أو عامل النمو وحده.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر خلط الجزيء المحب للماء المطلوب في محلول البولي إلكتروليت من نفس الشحنة الصافية لدمجه في الألياف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء سقالة بولي مركبة مع القدرة على التحكم في إطلاق جزيئات الشريط. يجب أن يسمح لك المكسب الكبير في هذا الفيديو بإنشاء سقالة رئوية مع القدرة على الإطلاق المستدام لعامل النمو ، وإطلاق عامل نمو متعدد ، وإنشاء تدرج من الإشارات الكيميائية الحيوية التي ستلخص المكانة الفسيولوجية.

لا تنس أن العمل مع الحمض الحمضي وهيدروكسيد الصوديوم وميثان الكلور يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الحماية الشخصية وغطاء الفيلم عند تنفيذ هذا الإجراء.