تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر في المختبر نموذج تجريبي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم نموذج جديد للشبكات العصبية ثلاثية الأبعاد في المختبر مقترنة بمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق التكييف الأول ، الجزء المركزي من MEA بمحلول مختلط من بولي دي ليسين ولامينين ثم قم بتغطية الميكروبيدات ببروتينات الالتصاق واللامينين والبولي ليسين. تتمثل الخطوة الثانية في توزيع تعليق الميكروبيدات المعالجة على صفيحة متعددة الآبار حيث سيتم تجميعها ذاتيا وتشكيل طبقة موحدة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في وضع الخلايا على المنطقة النشطة من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا بكثافة 2000 خلية لكل ملليمتر مربع لإنشاء شبكات عصبية ثنائية الأبعاد. بعد ست إلى ثماني ساعات من نقل تعليق الطلاء من الألواح متعددة الآبار إلى منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا ويسمح للميكروبيدات بالتجميع الذاتي في هيكل مضغوط سداسي. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصور الشبكات ثلاثية الأبعاد ، والتي تتم مقارنتها بالشبكات العصبية التقليدية ثنائية الأبعاد المزروعة عبر منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل مزارع الخلايا ذات الأبعاد BDI في المختبر ، هي أنه في نموذج أبعاد BDI ، يتم تسطيح مخاريط السوماتا والنمو ، ولا يمكن أن ينتشر Andon والارتفاع في جميع الاتجاهات. بالإضافة إلى ذلك ، يهيمن نشاط الانفجار على الديناميكيات الفيزيولوجية الكهربية لشبكات أبعاد BDI بينما في نشاط ثلاثي الأبعاد ، يتعايش أيضا نشاط البقع العشوائية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا الورقة البحثية لصوفي بوتو التي نشرتها في طريقة الطبيعة في عام 2008 ، والتي استخدمت فيها الميكروبتات كسقالة لبناء شبكات ثلاثية الأبعاد.

ثم قمنا بتكييف هذه الطريقة معي لعمل أول تسجيلات ثلاثية الأبعاد في المختبر. لتحضير المطاط الصناعي PDMS ، اخلطي عامل المعالجة والبوليمر بنسبة حجم من واحد إلى تسعة في طبق بتري. ثم رجي الخليط وضعيه في حجرة التفريغ لمدة 10 دقائق للتخلص من فقاعات الهواء.

لإنشاء قيود PDMS ، أدخل مادة PDMS في القالب الأقدم بعد ذلك ، ضعها في الفرن لمدة 30 دقيقة عند 120 درجة مئوية. يجب أن يكون لقيد PDMS شكل أسطوانة بقطر خارجي وداخلي يبلغ 22.0 و 3.0 ملم على التوالي ، وارتفاع 650 ميكرومتر في اليوم السابق للطلاء. قم بإقران القناع بالمنطقة النشطة من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا تحت مجهر استريو ، ثم قم بتعقيم قناع PDMS في الفرن على حرارة 120 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتعقيم الميكروبيدات الزجاجية في قارورة مخروطية من 70٪ من الإيثانول لمدة ساعتين ، يتم تدويرها كل 30 دقيقة لفضح جميع الميكروبيدات بعد ذلك. قم بإزالة محلول الإيثانول من القارورة واشطف الميكروبيدات مرتين بالماء المعقم. ثم قم بتكييف الجزء المركزي من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا المحدد بقناع PDMS ب 24 ميكرولتر من المحلول المختلط من البولي ليسين واللامينين بمعدل 0.05 ميكروغرام لكل ملليلتر.

قم بتغطية الميكروبيدات ببروتينات الالتصاق والصفائح والبولي ليسين بمعدل 0.05 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، ضعها في الحاضنة طوال الليل عند 37 درجة مئوية للحصول على شبكة عصبية مستقرة وطويلة الأمد. بعد ذلك ، قم بتوزيع تعليق الميكروبيدات المعالجة على الصفيحة متعددة الآبار باستخدام إدراج غشاء حيث سيتم تجميعها ذاتيا وتشكيل طبقة موحدة.

ثم املأ كل بئر من الغشاء ب 0.5 مل من المتوسط. ضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تصبح الخلايا العصبية جاهزة للطلاء في هذه الخطوة. بعد التضحية بأنثى فأر حامل E 18 ، احصل على أجنة الفئران ، ثم قم بإزالة فرس النهر من كل جنين فأر

ضعهم في هانكس المثلج. موازنة محلول الملح بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بفصل الأنسجة في 0.125٪ من محلول tryin Hanks الذي يحتوي على 0.05٪ من الحمض النووي لمدة 18 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة بيور. أوقف الهضم الأنزيمي عن طريق إضافة وسيط بنسبة 10٪ FBS لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة الوسط باستخدام FBS واغسله مرة واحدة بوسط النمو ، مكمله 1٪ L-glutamine و Gentamycin بمعدل 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط. أعد تعبئته مرة أخرى ب 500 ميكرولتر من النمو. متوسط. مكمل غذائي 1٪ L-glutamine و Gentamycin عند 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.

قم بفصل حبيبات الأنسجة ميكانيكيا باستخدام ماصة PEs ضيقة حتى يظهر معلق حليبي للخلايا. بعد ذلك ، قم بتخفيف حجم صغير من تعليق الخلية بوسط النمو للحصول على حجم نهائي يبلغ 2.0 ملليلتر. احسب التركيز الخلوي الذي تم الحصول عليه باستخدام غرفة مقياس الخلوي الدموي.

ثم قم بتخفيف هذا التركيز بنسبة واحد إلى خمسة من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوب من 600 إلى 700 خلية لكل ميكرولتر. ضع الخلايا بكثافة 2000 خلية لكل ملليمتر مربع على المنطقة النشطة من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا المحددة بواسطة قيود PDMS لإنشاء شبكة عصبية ثنائية الأبعاد. بعد ذلك ، ضع جهاز MEA في الحاضنة مع جو ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.

لإكمال الخطوة الأولية لبناء ثقافة ثلاثية الأبعاد ، قم بتوزيع 160 ميكرولتر من التعليق بتركيز خلية من 600 إلى 700 خلية لكل ميكرولتر على سطح الطبقة الأحادية للميكروبيدات الموضوعة داخل الألواح متعددة الآبار. ثم ضع الألواح متعددة الآبار في الحاضنة مع جو ثاني أكسيد الكربون المرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية ، بعد ست إلى ثماني ساعات من نقل الطلاء من 30 إلى 40 ميكرولترا من المعلق مع الميكروبيدات والخلايا العصبية إلى منطقة MEA المحددة بقيود PDMS. بعد كل عملية نقل ، انتظر حوالي نصف دقيقة للسماح للميكروبيدات بالتجمع الذاتي في هيكل سداسي.

بمجرد ترسيب جميع الطبقات وتجميعها تلقائيا عند 300 ميكرولتر من الوسط في الجزء العلوي من المنطقة المحددة بقيود PDMS. ضع الهيكل ثلاثي الأبعاد مقترنا بمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسط النمو مع مكملته بعد ثلاثة أسابيع في المختبر ، ويكون الهيكل ثلاثي الأبعاد مستقرا أيضا دون عرض قيود PDMS.

فيما يلي صورة DIC لطبقة واحدة من الخرز مقترنة بسطح MEA. يمثل موضع النقاط السوداء التخطيط المكاني للأقطاب الكهربائية. يعرض تلطيخ الفلورسنت المناعي للخريطة الثانية ، والذي تنعكس بالإشارة الحمراء ، توزيع الأشجار الشجيرية و ADA للخلايا العصبية حول الميكروبيدات المقترنة مباشرة بمستوى القطب الكهربائي في MEA.

تظهر هذه الصورة الحد الأقصى للإسقاط لتسلسل Zack لثقافة ثلاثية الأبعاد تعرض شبكة مترابطة للغاية حيث يتم تصنيف الخلايا العصبية ل N جديد معبرا عنها في الخلايا العصبية الناضجة بعد الانقسام. وبالنسبة إلى gaba ، إليك التسجيل الفيزيولوجي الكهربي التمثيلي لشبكات الحصين في تكوين ثلاثي الأبعاد. وإليك التسجيل الفيزيولوجي الكهربي التمثيلي لشبكات الحصين في تكوين ثنائي الأبعاد.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذا الإجراء في سبع ساعات. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه نظرا لأن الإجراء يحتوي على عدة خطوات تم إجراؤها خلال يوم مختلف ، فإن تقدير الوقت لتحقيق الإجراء بأكمله هو مجرد مؤشر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أولا وضع طبقة ثنائية الأبعاد من مدر للبول العصبي إلى قطب mea ، ثم نقل تعليق البتات الدقيقة والخلايا العصبية بعناية فائقة من اللوحة متعددة الآبار إلى mea من أجل تحقيق الهيكل ثلاثي الأبعاد بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب الحسابي لاستكشاف كيف يمكن لاتصال الشبكة تشكيل ديناميكيات الشبكة الناشئة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء شبكة عصبية ثلاثية الأبعاد في المختبر مقترنة بمصفوفات الأقطاب الكهربائية الصغيرة.