A للمسح في فيفو الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد سمية الميتوكوندريا أو الآثار المفيدة للأدوية باستخدام الكائن الحي النموذجي. أناقة ج. يتم تحقيق ذلك من خلال القياس الكمي في الجسم الحي لمستويات TP في سلالات elgan البحرية المعدلة وراثيا التي تعبر عن الإنزيم الصليبي اليراعي المدمجة في بروتين الفلورسنت الأخضر.

يمنح جين الاندماج خاصيتين متميزتين للديدان الخيطية. الأول هو أنه عند إعطاء الركيزة لوسيفر ، تنبعث الديدان الخيطية من الضوء في النطاق المرئي بما يتناسب مع احتياطيات A TP الخلوية. والثاني هو أنه عندما تضيء بالطول الموجي المناسب ، فإنها ستظهر مضان أخضر قوي.

التألق مستقل عن الديدان الخيطية مستويات TP ويتناسب مع كتلتها أو أعدادها. لذلك ، يمكن استخدامه لتطبيع قياسات التلألؤ البيولوجي. أثناء الفحص النموذجي ، يتم زراعة مجموعة من الديدان المتزامنة نمويا إلى مرحلة اليرقات الأربعة L.

ثم يتم معالجة الديدان الخيطية بمركبات دواء الاختبار لفترة من الوقت قبل قياس كل من التألق والتلألؤ البيولوجي. تظهر النتائج سمية محتملة للأدوية. عندما يتم تقليل التلألؤ البيولوجي ، تشير الإشارة المحسنة إلى نتيجة لمزيد من الاختبارات للتأثيرات المفيدة على وظيفة الميتوكوندريا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فحص الأدوية على الخلايا المستنبتة ، هي أن الفحص يتم إجراؤه في السياق الفسيولوجي لكائن حي كامل متعدد الخلايا مع ما يقرب من 50٪ من طب العيون الجيني للبشر. ومثل البشر ، تتطلب الأناقة في الواقع فسفرة الأكسدة في الميتوكوندريا لتتطور إلى مرحلة البلوغ ، كما تشترك الميتوكوندريا مع الميتوكوندريا في الثدييات في العديد من الخصائص من حيث هيكلها ووظيفتها وطاقتها الحيوية تشمل المعلمات الحاسمة داخل البروتوكول المرحلة التنموية التي بدأ فيها التعرض طول التعرض للديدان الخيطية ، إلى الدواء ذي الأهمية وبذر عدد مماثل من الديدان الخيطية لكل من الآبار ، وبالطبع تجنب التلوث في اليوم الأول. في ظل ظروف معقمة ، انقل الديدان الخيطية من لوحة وسائط نمو الديدان الخيطية التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات في ملليلترين من الوسط الكامل S إلى قارورة تحتوي على 30 جراما لكل لتر من الإشريكية القولونية.

OP 50 في S وسط كامل ، ثم احتضان القارورة مع الرج في اليوم الرابع ، وتبييض مزرعة الديدان الخيطية الوراثية لحصاد البيض ومزامنة مجموعة الديدان. ثم احتضان البيض طوال الليل في قارورة زجاجية تحتوي على 15 مل من S كامل الوسط مع رج في اليوم التالي ، اليوم الخامس ، ستكون الديدان الخيطية في نفس مرحلة النمو. لتحديد عدد الديدان المفرغة باستخدام طرف نظيف في كل مرة ، انقل ثلاث 100 ميكرولتر من الديدان الخيطية إلى أنابيب صغيرة منفصلة تحتوي على 900 ميكرولتر من الوسط ، مكملة ب 0.01٪ tween 20 ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لإطلاق أي ديدان ملتصقة بالطرف.

ثم عد الديدان الخيطية في أربعة قطرات منفصلة سعة 10 ميكرولتر من كل أنبوب من أنابيب التخفيف الثلاثية ، واحسب حجم تعليق الديدان الخيطية المطلوب لإعداد مزرعتين سعة 20 مليلتر مع 10 ديدان خيطية لكل 10 ميكرولترات ، وصب الأحجام التقريبية في أنبوبين مخروطيين مزن مسبقا سعة 15 ملليلترا. قم بوزن الأنابيب لتحديد الحجم الفعلي الذي تم توزيعه. ثم لضبط دوامة الأحجام المستهدفة برفق وإزالة الحجم الزائد.

الآن ، اغسل الديدان الخيطية بإجمالي 14 مل من S الطازج ، ووسط كامل لكل أنبوب الكريات في خمسة ملليلتر من S كامل وسط مع 30 جراما لكل لتر من التساوي. منطوق 50. انقل الديدان الخيطية إلى قوارير زجاجية مخروطية تحتوي على 15 مل من S كاملة مع 30 جراما لكل لتر من التساوي.

OP 50 إلى حجم إجمالي يبلغ 20 مل لكل قارورة وتسجيل وقت التغذية. متوسط عدد الديدان الخيطية في تسعة قطرات 10 ميكرولتر للتأكد من أن المزارع مخففة إلى 10 ديدان خيطية لكل 10 ميكرولترات. ضع المزارع في الحاضنة لمدة 42 إلى 44 ساعة.

في اليوم السابع ، اسحب مزارع الديدان الخيطية في قارورة واحدة مع دوامة لطيفة مستمرة. ثم انقل ثلاثة أو أربعة مليلتر من الديدان الخيطية إلى حوض معقم واحد سعة 60 ملليلترا. استخدم ماصة ثماني قنوات إلى Eloqua ، 25 ميكرولترا من الديدان الخيطية العالقة لكل بئر في 96.

ألواح ميكروتيتر سوداء مع قيعان مسطحة وشفافة. ثم أعد الأغطية إلى الأطباق واترك الأطباق جانبا. في كل مرة يتم فيها زرع طبقتين ، انقل قطعتين أخريين ، 2.5 ملليلتر من الديدان الخيطية إلى الحوض الصغير لاستبدال الحجم المفقود.

بعد بذر 13 إلى 14 طبقا بالديدان الخيطية ، أضف 74 ميكرولترا من الوسط الكامل S إلى كل بئر وانقل الألواح إلى غرفة رطبة وحاضنة اهتزاز حتى إعطاء الدواء ، بينما تهتز الألواح. قم بإذابة 2 96 لوحة دواء ملحومة للاختبار. ثم استخدام ماصة متعددة القنوات وتغيير الأطراف في كل مرة.

انقل ميكرولتر واحد من العمود الأول من لوحة الدواء الأولى إلى الأعمدة من واحد إلى خمسة من لوحة الديدان الخيطية. انقل ميكرولتر آخر من العمود الثاني من لوحة الدواء إلى الأعمدة من ثمانية إلى 12 من لوحة الديدان الخيطية. ثم أضف ميكرولتر واحد من السيارة إلى العمودين السادس والسابع من لوحة الديدان الخيطية.

استخدم الأعمدة المتبقية في لوحة الدواء لمعالجة بقية ألواح الديدان الخيطية بنفس الطريقة ، مع التأكد من تضمين لوحين معالجتين لجميع المركبات أيضا. ثم أعد جميع الأطباق إلى الغرف الرطبة في الحاضنة المهتزة لمدة 20 إلى 22 ساعة أخرى في اليوم الثامن. لإعداد لوحة تحكم في الخلفية لقراءات التألق ، امزج محتويات البئر من لوحة الديدان الخيطية المعالجة بالكامل واسمح للديدان الخيطية بالاستقرار لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

ثم اجمع البكتيريا التي تحتوي على snat وقم بتحميل 100 عينة ميكرولتر في كل بئر من صفيحة سوداء ذات قاع شفاف. راقب اللوحة تحت المجهر ، مع ملاحظة الآبار التي يمكن فيها رؤية الديدان الخيطية للسماح باستبعاد هذه الآبار من تقدير الخلفية الفلورية. ثم اقرأ التألق أخيرا لقياس التلألؤ البيولوجي لكل لوحة.

في المقابل ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت الطازج المحضر لكل منها ، ضع اللوحة جيدا على منصة اهتزاز وابدأ المؤقت بعد ثلاث دقائق. اقرأ اللمعان في ثانية واحدة لكل قياس. في هذه التجربة التمثيلية الأولى ، قلل العفن المعروف بمثبط الميتوكوندريا المركب من ناتج الضوء بواسطة الديدان الخيطية بعد تعرضات قصيرة وأطول نسبيا في مجموعة من التركيزات.

في هذه التجربة ، ثبت أن مبيد الأعشاب باراكوات يقلل بشكل كبير من تألق GFP الحيوي والتلألؤ البيولوجي الطبيعي للسلالة C PE 2 54. علاوة على ذلك ، كان انخفاض التلألؤ البيولوجي أكبر من انخفاض التألق ، بما يتفق مع التأثيرات المعروفة لانخفاض وظيفة الميتوكوندريا وتقليل إنتاج TP الناتج عن الدواء. يوضح هذا الرسم البياني مثالا على مركب يعزز التلألؤ البيولوجي للديدان الخيطية ، وهو دورة حمض الستريك أوكسالو أسيتات وسيطة بتركيز واحد يبلغ ثمانية مللي مولار.

لاحظ أن التباين التجريبي الذي شوهد بين عمليات التشغيل المتماثلة هذه ليس غير معتاد بالنسبة للتجارب القائمة على لوسيفر. هنا ، لوحظ أن المركبات المثبطة لوسيفيراز اليراع تؤثر على نشاط اللوسيفر في المختبر عند 25 ميكرومولار و 100 ميكرومولار مع توهين شبه كامل للنشاط بواسطة مركب DDD. 1 ، 4 3 4 ، على الرغم من عدم قابلية المقارنة بشكل مباشر ، لوحظ انخفاض كبير في التلألؤ البيولوجي بعد العلاج المركب المثبط لوسيفر في الجسم الحي أيضا.

إثبات أن التغيرات في التلألؤ البيولوجي قد تنجم عن عمل مثبطات إنزيم لوسيفر بدلا من التغيرات في مستويات TP في الجسم الحي A. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم مراعاة أن المركبات يمكن أن تؤثر على نشاط إنزيم لوسيفيراز اليراع بشكل مباشر بدلا من التأثير على حالة طاقة الدودة. وبالتالي ، يمكن التحقق من صحة درجات الحرارة الفرعية باستخدام العديد من التقنيات لتقييم وظيفة الميتوكوندريا ، مثل ، على سبيل المثال ، تحديد استهلاك الأكسجين ، أو تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا لأنواع الأكسجين التفاعلية ، أو تصور الميتوكوندريا في سلالات من أناقة البحر.

مع علامة GFP ، الميتوكوندريا.