Name: A للمسح في فيفو الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية انواع معينة ايليجانس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: تعلم كيفية الكشف عن تثبيط الميتوكوندريا في الكائنات الحية باستخدام Caenorhabditis elegans المعدل وراثياً. يتيح هذا البروتوكول فحص مكتبات الأدوية لتحديد المركبات التي تؤثر على وظائف الميتوكوندريا.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا ديفيد جراي من وحدة اكتشاف المخدرات في دندي على التبرع بالمركبات المثبطة للوسيفيراز اليراع DDD00001434 و DDD0001477 و DDD00000635 و DDD00023047. تيبور هاركاني (جامعة فيينا الطبية) لاقتراح أوكسالو أسيتات كمركب اختبار. وتشارلي عزيز (جامعة أبردين) للرسوم التوضيحية. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة BBSRC Pathfinder (BB / FOF / PF / 4/11) وجامعة أبردين.

<ol><li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+phenotypic+gap%3A+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7(2008).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%2C+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li>
<li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503(2012).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobacco-specific+nitrosamine+4-%28methylnitrosamino%29-1-%283-pyridyl%29-1-butanone+%28NNK%29+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content%2C+transcription%2C+ATP+production%2C+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9(2013).</li>
<li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li>
<li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li>
<li>Lagido, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLagido%2C+C+%22Nematodes+as+environmental+indicators%22">Nematodes as environmental indicators</a>. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).</li>
<li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+in+chemical+biology%3A+a+compendium+of+inhibitors%2C+mechanistic+evaluation+of+chemotypes%2C+and+suggested+use+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li>
<li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li>
<li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li>
<li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877(2013).</li>
<li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7%2C+two+major+components+of+the+hypodermis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress%3A+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Grow+or+Not+to+Grow%3A+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li>
<li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li>
<li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Test+Mater%22%5BJournal%5D)">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li>
<li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH%2C+salinity%2C+and+hardness+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Con+Tox%22%5BJournal%5D)">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li>
<li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li>
<li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

الكائن الحي نموذج C. يوفر ايليجانس نظام تجريبي قوي. فمن السهل أن تنتج ثقافة وفيرة ذرية متطابقة جينيا مع دورة حياة 3.5 يوم من البيض لاستنساخ الكبار (عبر مراحل اليرقات الأحداث L1 حتى L4). ونظرا لصغر حجمه، فإنه يمكن زراعتها بشكل ملائم في لوحات 96-جيدا، وتسهيل فحص المركبة. نقدم بروتوكول الفحص المظهري بناء على سلالات C. ايليجانس التي تقوم بدور في الجسم الحي أجهزة الاستشعار من مستويات الطاقة. 14 البروتوكول ينطبق على أي مختبر، على الرغم من أن هناك حاجة إلى luminometer لوحة 96-جيدا والحكومة العقيمة. من المهم لمنع التلوث في فحوصات باستخدام تقنية المختبرات الجيدة. إذا كان يعمل يدويا، والحد الأقصى لعدد لوحات الديدان الخيطية يمكن تحقيقه هو 13 في التجربة السماح للاختبار 2X لوحات المخدرات 96-جيدا وبينهم اثنان من لوحات المركبات. يتم عرض نتائج ممثل للمجمع الميتوكوندريا I المانع rotenonه، مولد الباراكوات الفائق، ودورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسطة وأربع مركبات مع المعروف النشاط المثبطة يراعة luciferase. أدت المركبين الأولى إلى انخفاض في تلألؤ بيولوجي كما كان متوقعا في حين أوكسالوآسيتات أدى إلى تعزيز، من المرجح أن يؤدي من جيل أكبر من ATP. تظهر أيضا مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات التغير الجوهري في تجاربه التي تستند إلى يراعة luciferase كمراسلة. ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة لا ينصح للتأكد من متانة الردود على مركبات غير معروفة. وتثبيط النشاط يراعة luciferase التعرف مع فحص في المختبر باستخدام طقم التجارية. 3 واحدة من المركبات أدى إلى زيادة كبيرة في GFP مضان بما يتفق مع مثبط زيادة مستويات يراعة luciferase المراسل ملزمة لانزيم luciferase المراسل النشط الموسومة GFP الموقع، وجعله أكثر استقرارا. 15 وفي بعض الحالات(وليس في هذه الحالة بالذات) وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة مستويات تلألؤ بيولوجي عند النازحين المانع من قبل الركيزة الزائدة. 15. ولذا، من المهم عدم تفسير النتائج خطأ من المركبات التي تتفاعل مع انزيم يراعة كما انخفضت أو زيادة مستويات ATP / وظيفة الميتوكوندريا. التغييرات في إشارة التلألؤ في كثير من الأحيان ترتبط مع قياسات إضافية للصحة مثل الحركة والتطور والنمو. وكمثال على ذلك، وهو مركب هو luciferase المراسل المانع المشتبه به إذا تم الكشف عن الانخفاض الكبير في إشارة تلألؤ بيولوجي لكن الديدان لا يمكن تمييزها من الضوابط من خلال الملاحظة المجهرية. زيادة في GFP مضان، لا يفسر النمو أو مركب تألق ذاتي، قد يشير أيضا إلى المانع. ومن المعروف أن عددا من مثبطات luciferase المراسل 15، وقد دخلت حيز PubChem. لذلك، في المقام الأول، بل هو ممارسة جيدة للتشاور معلومات عن مثبطات luciferase المراسل تحتجزهم PubChem. تليها رesting من آثار مركب في فحوصات في المختبر مع انزيم المنقى 3 و / أو تأكيد من آثار على وظيفة الميتوكوندريا من قبل وسائل إضافية. 16،17 قياسات GFP مضان تمكين الكشف عن مستويات يراعة luciferase (والكشف المحتمل لبعض مثبطات انزيم luciferase المراسل كما نوقش أعلاه) مما يجعل حجة قوية لقياس هذه النهاية جنبا إلى جنب مع تلألؤ بيولوجي حيثما كان ذلك ممكنا. تطبيع قراءات تلألؤ بيولوجي لGFP هو أيضا وسيلة لتوضيح أسباب الاختلاف في الأرقام دودة بين الآبار (على الرغم من أن هذا يمكن أيضا أن يتحقق عن طريق إدراج مكررات التقنية متعددة). لمزيد من حساسية، من المهم طرح مضان الخلفية من القراءات. بروتوكول يقيم مساهمة تعليق البكتيرية إلى مضان الخلفية، ولكن لا تمثل الديدان الخيطية تألق ذاتي ل(وجود قيود على الفحص الحالي، حاسمة بشكل خاص لأي ستو الشيخوخةوفاة بالنظر إلى أن الزيادات الخيطية تألق ذاتي مع التقدم في السن). وينبغي أيضا تقييم تألق ذاتي من المركبات اختبار في نفس الوقت. سوف GFP تطبيع يبدو لا غنى عنه حيث يرغب الباحثون على التكيف بروتوكول لمقارنة حمامات ATP الخلوية في المسوخ وراثية مختلفة، أو بعد إسكات الجينات المختلفة، من أجل السيطرة على أي اختلافات الضغط على مستوى التعبير عن التحوير تلألؤ بيولوجي. وتشمل المعايير الضرورية ضمن بروتوكول المرحلة التنموية التي يبدأ التعرض، ومدة التعرض، والحصول على أرقام مماثلة من الديدان الخيطية في آبار مختلفة. التعرض يمكن أن يبدأ في أي مرحلة من مراحل التنمية من الديدان الخيطية، ولكن مرحلة L3 أو أقدم الأفضل. من هذه المرحلة على والديدان الخيطية تعتمد على الفسفرة التأكسدية للتنمية في مرحلة البلوغ، كما يتضح من زيادة كبيرة جدا في المحتوى و mtDNA، واستهلاك الأوكسجين ومستويات ATP. 18،19،20 هذا البروتوكول يبدأ المعارضلدى عودتهم في المرحلة L4. سبب aliquoting الديدان الخيطية لوحات 96-جيدا فقط في هذه المرحلة (وليس عندما قدمت لأول مرة في المواد الغذائية في مرحلة L1)، هو أنه على الرغم من وضع لوحات في غرف رطبة لتقليل التبخر، وعلى درجة التبخر لا يزال يحدث في لدينا حاضنة الهز، وينظر إليها على أنها قطرات صغيرة جدا تتشكل على الجفن (وهذا قد لا يكون مشكلة مع حاضنات تهز أخرى). بواسطة aliquoting الديدان الخيطية لوحات قبل إضافة معايير المخدرات، لا يتأثر تركيز الدواء الفعلي من قبل أي اختلاف صغير في الحجم بسبب التبخر. تحميل لوحة الخيطية مع السيارة هو مفيد فقط للتأكد من أن الديدان الخيطية وزعت بالتساوي بين الآبار. فإن أي اختلافات كبيرة تم العثور عليها ل السيارة لوحة فقط يكون مؤشرا على تقنية الفقيرة في الاستغناء عن النيماتودا إلى الآبار. طول التعرض هو عامل مهم للنظر فيها. إذا كانت الآثار على وضع الطاقة بشكل مستقل من النمو هي التي تهم، والمؤيديمكن تعديل tocol لاستيعاب التعرض أقصر (من استجابات فورية تقريبا، على سبيل المثال، 2 ساعة). من ناحية أخرى، دخول المركبات إلى C. الأنسجة ايليجانس قد يستغرق بعض الوقت. على سبيل المثال يطلب من 12-24 ساعة لتحقيق أقصى قدر من تركيزات الداخلية ريسفيراترول و 5 الفلورية 2&#39;-deoxyuridine (FuDR). 21 لذلك، التعرض الطويل (18-24 ساعة) قد يكون له ما يبرره لتحقيق أقصى قدر من مستويات التعرض. الساعة التعرض ينبغي أن يقتصر على الأوقات التي لا تسمح مستويات كبيرة من الاستنساخ الذي سيعقد في البئر. ونحن نوصي بأن الوقت التنموي الكلي للالنيماتودا يتم الاحتفاظ تحت 66-67 ساعة. على الرغم من مريحة، وحامل الديدان الخيطية في ذلك الوقت، وقد بدأت egglaying. ومع ذلك وجدنا قراءات تلألؤ بيولوجي من الاستعدادات البيض لا تذكر (لا يظهر). يتم الكشف عن سور 5 المروج يحركها التعبير التحوير أول اثنين فقط لمدة سنتين وبعد نصف ساعة الإخصاب في مرحلة 100 خلية 22 وجومن المرجح أن تحد من دخول وسيفيرين قشر البيض hitinous. ووجد آخرون أن البيض المحتوي لم تساهم بشكل كبير في عملية التمثيل الغذائي للبالغين حامل. 23 ومع ذلك، والظروف التي تسمح بانتاج كبير ذرية هي التي ينبغي تجنبها. إذا كان يفضل، والجدول الزمني التجريبي يمكن أن تحول مرة أخرى: بادرنا قبل التعرض لسموم البيئية في أواخر L3 مرحلة اليرقات (36 ساعة) والتي أجريت القياسات تلألؤ بيولوجي وGFP في 55 ساعة 2 الخلفيات بدلا من ذلك، الوراثية التي هي عقيمة مشروط. يمكن استخدامها لمنع إنتاج ذرية، وعلى سبيل المثال فر-15 (B16) II. لا ينصح فيم-1 (hc17) IV متحولة المزدوج الذي لا يمكن الحفاظ عليه في 15 ° C، ولكن غير معقمة في 25 ° C. 24 استخدام FuDR للحث على العقم وهذا يمكن أن يؤثر في حد ذاته عملية التمثيل الغذائي الديدان الخيطية. 25 الفحص يمكن أن كما أن يؤديها في التوترات مع البشرة أكثر نفاذية مثل جزئية الخسارة من وfunctأيون حافلة 8 المسوخ التي هي نتيجة لزيادة نفاذية الأدوية الحساسة للأدوية المتعددة. 26 وهذا يسهل التعرض أقصر وتركيز مركب أقل. الشروط لإضافة وسيفيرين لهذه الديدان الخيطية يمكن أيضا تحتاج التعديل أي 1٪ DMSO و 0.05٪ تريتون-X100 في المخزن المؤقت التلألؤ قد لا تكون هناك حاجة لتعزيز توافر وسيفيرين. يستخدم بروتوكول 1٪ DMSO كما سيلة لتسليم المجمع. وإن لم يكن قاتلا، وهذا تركيز DMSO لديه بعض التأثيرات البيولوجية كما ناقشنا في منشور السابق. 3 العديد من المكتبات المخدرات المتاحة مستعدون في 100٪ DMSO، بتركيزات من شأنها أن تكون مناسبة لفحوصات خلية القاعدة بعد التخفيف من السيارة إلى 0.1٪. ويلزم تركيز مركب أعلى للحصول على ردود في C. ايليجانس بالمقارنة مع الخلايا البشرية، بحيث غالبا ما يكون من غير الممكن إجراء فحوصات على أقل من 1٪ DMSO. مرة أخرى، واستخدام سلالات معقد يؤدي المزيد من البشرة منفذة لاختبار مع تركيزات أقل من المركبات. لا ينصح تركيزات DMSO أعلى من 1٪. ينبغي التقيد الوقت المحدد الحضانة مع وسيفيرين قبل قراءات ل. كما هو موضح سابقا، التلألؤ يصل أقصى مستويات لها في الدقيقة الثانية بعد إضافة وسيفيرين، وتبقى مستقرة نسبيا لأول 5 دقائق، تليها انخفاض تدريجي بطيء في التألق على مدى 30 دقيقة المقبل 1. ويمكن إجراء استجابات حركية لمادة كيميائية معينة من خلال هذه المرحلة الأولية من 30 دقيقة بعد الاستغناء الأولي من وسيفيرين. ويشمل البروتوكول خطوة جوعا بعد جمع البيض لتحقيق التزامن من السكان الديدان الخيطية. نوصي تزامن السكان اختبار النيماتودا منذ مراحل النمو المختلفة تختلف في مستويات ATP الخلوية وربما تستجيب بشكل مختلف للمركبات الاختبار. من خلال تنفيذ المجاعة في S كاملةمتوسطة بالمقارنة مع M9، يتم توفير الديدان الخيطية الفقس مع مصدر الكربون (الإيثانول)، بحيث اليرقات لا تتطور ولكنها لا تفتقر تماما. 27،28 كما تبين أن القبض على L1 وتستعد للاستجابة السريعة في الغذاء و ويتم تحقيق معدل نمو L1 العادي في غضون 3 ساعة بعد الغذاء تصبح متوفرة. 29 ومع ذلك، فإنه احتمال أن الخطوة المجاعة قد يغير التمثيل الغذائي للC. لا يمكن استبعاد ايليجانس. 30 لهذا السبب طول الجوع يجب أن لا تتجاوز 24 ساعة (18 ساعة كافية لمزامنة). قد يكون بعض المختبرات في إمكانية استخدام COPAS Biosorter لمزامنة عمر تجاوز الخطوة الجوع تماما. قد يكون غيرها من المختبرات تفضيل لتوسيع السكان الخيطية على وسائل الاعلام الصلبة (لوحات NGM مع OP50) قبل التبييض (الخطوة 3.1) وهذا سوف تعمل بشكل جيد جدا. نحن نستخدم S المتوسطة خلال التعرض مجمع كوسيلة القياسي لالنيماتودا زراعة، howeveص يمكن اختيار وسيلة أخرى، على سبيل المثال K متوسطة أو معتدلة EPA الماء العسر غالبا ما تستخدم للدراسات السمية البيئية. 31،32 وينص البروتوكول وسيلة لفحص وتحديد المرشحين لإجراء مزيد من التجارب من حيث الآثار المترتبة على وظيفة الميتوكوندريا. في مرحلة الفرز الأولية أنه من المحتمل أن يكون قد تم تفويت بعض المركبات بسبب تركيز واحد فقط يجري اختبارها، وبالتالي لا ينبغي النظر شاشات المخدرات شاملة. يضرب يمكن التحقق من صحة عن طريق استخدام تقنيات لتقييم جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا للاستهلاك الأكسجين سبيل المثال، C. ايليجانس سلالات مع GFP معربا عن الميتوكوندريا، البقع على إمكانات غشاء الميتوكوندريا و / أو القياسات ROS. 16،33،34 أعظم أهمية المنهجية هو أن يكون وسيلة لفحص عدد كبير من المركبات و / أو شروط على المستوى العضوي متعددة الخلايا، والأهم من ذلك أن تكون قادرة على الاستفادة من الالبريد قابلية الإستطراق الجيني للC. ايليجانس للتحقيق في آليات العمل. تقنية قد تساعد على تسريع وإيجاد مسارات جديدة لاكتشاف مركبات والأهداف مثيرة للاهتمام. ومن المتصور أن الجمع بين أجهزة الاستشعار مع خلفيات وراثية مرتبطة الأمراض التي تصيب البشر لفرز مجموعات المركبات الكيميائية في سياق ذي صلة المرض سيكون لها الكثير لتقدمه.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير سريع للوضع الطاقة في C. ايليجانس في الجسم الحي بهدف استخدام هذا بمثابة نقطة النهاية في فحص المركبة. ويستند هذا المنطق على التعبير المعدلة وراثيا من يراعة luciferase في C. الخيطية ايليجانس 1-3 عن طريق البلازميد pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> وتنصهر انزيم luciferase المراسل إلى بروتين الفلورية الخضراء GFP وأعرب جوهري وبتواجد مطلق في السيتوبلازم (تم إزالة بيروكسية luciferase المراسل استهداف إشارة). وهذا يؤدي إلى انبعاث الضوء عندما يتم توفير الركيزة luciferin خارجيا. كما الدودة شفافة، وعلى ضوء يمكن قياسها في luminometer وحدات الخفيفة النسبية (RLU). الوقود ATP الخلوية رد فعل تلألؤ بيولوجي وتوافره يحدد مستويات الخفيفة المنتجة. ونتيجة لذلك، luminometry يقدم مريحهر يعني تقييم مستويات ATP النسبية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا، لأن إنتاج ATP يحدث بشكل رئيسي في الميتوكوندريا. وقد ثبت وجود صلة بين مستويات ظيفة وتلألؤ بيولوجي الميتوكوندريا سابقا من خلال إسكات الجينات الميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون ويصاحب ذلك انخفاض ناتج الضوء. 1 سلالات تلألؤ بيولوجي ولدت وعينت PE254 (feIs4) و PE255 (feIs5) 1 (انظر قائمة المواد)، ويمكن أن تستخدم بالتبادل. 3 وقد استخدمت عدد من الدراسات هذه السلالات استشعار للإبلاغ عن مستويات ATP الخلوية في الجسم الحي بعد التعرض لمواد كيميائية مختلفة أجنبي بيولوجيا مثل أزيد الصوديوم 1، الكادميوم 2 والصرف الصحي استخراج الحمأة 3، 5&#39;-الفلورية 2-deoxyuridine 6، ونيتروسامين التبغ محددة 7. وكانت سلالات من المفيد أيضا رصد تأثيرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية C <sتصل&gt; 8 وآثار تعطيل سلسلة الميتوكوندريا وظيفة الجهاز التنفسي. 1،9 كما تم استخدام نسخة مبكرة من أجهزة الاستشعار التلألؤ التعبير عن الجينات luciferase المراسل دون الانصهار GFP (PE39) في التحقيق في آثار المعادن الثقيلة وعلى الجهاز التنفسي . uncoupler 10 سلالات PE254 PE255 وتحمل luciferase المراسل: تبين GFP الانصهار وGFP مضان لزيادة متناسبة مع النيماتودا الإعلام، حيث تتيح وسيلة مريحة للتطبيع القيم التلألؤ 6،9 آثار مبلغ الفرق من الديدان لكل بئر ويمكن أيضا أن يكون. تؤخذ بعين الاعتبار من قبل بما في ذلك مكررات تقنية متعددة في مقايسة (ما لا يقل عن 5 آبار في حالة). 3 بروتوكول يتيح إمكانية الرصد في الجسم الحي من مستويات الطاقة (على العكس من أكثر شاقة من الناحية الفنية في المختبر قرارات ATP) مما يتيح فحص المركبة وتغيير وضعيتها في سياق الفسيولوجية لمو كلهكائن lticellular. ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى مجموعة متنوعة من خلفيات وراثية عن طريق عبور التحوير متكاملة صبغويا إلى سلالات متحولة المتاحة و / أو إسكات الجينات التي تدخل الحمض النووي الريبي. وهكذا، مع الاستفادة الكاملة من C. ايليجانس بوصفه الكائن نموذج. يجب أن الأسلوب تساعد في الحد من فشل المرحلة في وقت متأخر من المرشحين المخدرات نظرا لسمية الميتوكوندريا وتقديم مساهمة نحو الحد من أعلى التجارب على الحيوانات.

<table><tbody><tr><td>Orion II Microplate Luminometer</td><td>Berthold Detection</td><td></td><td>Systems مع حاقن وبرنامج Simplicity 4.2 ؛ نقل البيانات إلى Excel في نهاية قياس اللوحة</td></tr><tr><td>FLx800 fluorimeter &nbsp ؛</td><td>Biotek</td><td></td><td>مع برنامج Gen5 ؛ نقل البيانات إلى Excel في نهاية قياس اللوحة</td></tr><tr><td>Ks 130 منصة الاهتزاز الأساسية</td><td>Ika</td> <td># 0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>شاكر حاضنة</td>التبريد <td></td><td>العلمي نيو</td></tr><tr><td>برونزويك جهاز الطرد المركزي Eppendorf 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>مع دوار eppendorf A-4-44 &nbsp ؛ (ل 50/15 &# 160 ؛ أنابيب مل)</td></tr> <tr><td>Stripette ، Costar</td><td>Corning</td> <td># 4489</td><td>ماصة مصلية</td></tr><tr><td>Cellstar 50 مل أنابيب</td><td>Greiner bio-one</td> <td># 227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 مل أنابيب</td><td>Greiner bio-one</td> <td># 188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 مم لوحات زراعة الأنسجة &nbsp ؛</td><td>Greiner bio-one</td> <td># 628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>VWR</td> <td># 631-0909</td><td></td></tr><tr><td>ملعقة معقمة</td><td>Corning</td> <td># 3007 ؛ # 3004</td><td>لوزن المواد الكيميائية</td></tr><tr><td>0.22 ملي مولار مرشحات Millex GP</td><td>Millipore</td> <td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب Axygen eppendorf 1.5 مل</td><td>Fisher Scientific</td> <td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 لوحة فحص البئر</td><td>VWR #</td> <td>3603</td><td>صفيحة سوداء قاع شفاف مع غطاء</td></tr><tr><td>Nunc 96 لوحة فحص البئر</td><td>فيشر العلمية</td> <td># 236105</td><td>صفيحة بيضاء مع غطاء</td></tr><tr><td>كاشف الخزان 60 مل</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td> <td># 9510027</td><td>تستخدم كحوض للديدان الخيطية في قسم البروتوكول 4.4.1</td></tr><tr><td>صندوق التخزين / غرفة رطبة</td><td>تشخيص Roche</td> <td># 10 800 058 001</td><td>174 × 101 × 56.6 مم ، تستخدم كغرفة رطبة مع مناشف ورقية مبللة ؛ يمكن أن تتناسب ألواح 2x 96-well مع أغطية واحدة ، حيث يجلس الجزء السفلي أعلى غطاء صفيحة صغيرة</td></tr><tr><td>التبييض: محلول هيبوكلوريت الصوديوم 4-4.99٪ محتوى الكلور</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># 239305</td><td>تخزين في aliquots في 4 & # 160 ؛ &deg; ج,&nbsp; ختم مع Parafilm لمنع فقدان الكلور والغطاء في رقائق</td></tr><tr><td>D-Luciferin ، ملح البوتاسيوم</td><td>Biotium Inc</td> <td># 10101-2</td><td>يمكن أيضا استخدام المجسات الجزيئية كمورد ؛ إعداد مخزون 20 ملي مولار في ddH 2 O ، احتفظ بها عند -20 درجة ؛ C في aliquots</td></tr><tr><td colspan = "4" > [header]</td></tr> <tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td> <td># 317275</td><td>نقاء 99.99٪</td></tr> <tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td> <td>#A16046</td><td>Diltute إلى 10٪ في ddH 2</td></tr><tr><td>O Nystatin</td><td>CalBiochem</td> <td># 475914</td><td></td></tr> <tr><td> C. elegans سلالات مضيئة بيولوجية</td><td>يحتوي مختبر</td><td>PE254 الخاص بالمؤلف PE255</td><td>على مصفوفات متكاملة feIs4 و feIs5 [Psur-5::luc +::gfp; rol-6(su1006)] على التوالي على الكروموسوم V و X؛ اختر للتعبير المتجانس والقوي عن luc::GFP عن طريق المجهر الفلوري (e.g. اختر 15 دودة) بين الحين والآخر.</td></tr><tr><td> الإشريكية القولونية < / م > OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كيماويات عامة</td><td>سيجما ألدريتش / فيشر ساینتفيك</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

الكائن الحي النموذجي متعدد الخلايا Caenorhabditis elegans هو ديدان خيطية صغيرة يبلغ حجمها حوالي 1 مم في مرحلة البلوغ وقابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا. إنه اقتصادي وسهل الاستزراع والتوزيع في وسط سائل مما يجعله مناسبا تماما للفحص متوسط الإنتاجية. لقد تحققنا سابقا من صحة استخدام لوسيفيراز معدل وراثيا يعبر عن C. ايليجانس سلالات لتوفير تقييم سريع في الجسم الحي لمستويات ATP للديدان الخيطية. 1-3 نقدم هنا المواد والإجراءات المطلوبة لإجراء المقايسات الحيوية باستخدام سلالات C. elegans المضيئة بيولوجيا PE254 أو PE255 (أو أي من سلالات مشتقاتها). يسمح البروتوكول بالكشف في الجسم الحي عن التأثيرات شبه المميتة للأدوية التي قد تحدد سمية الميتوكوندريا ، وكذلك للكشف في الجسم الحي عن التأثيرات الدوائية المفيدة المحتملة. يتم توفير نتائج تمثيلية للمواد الكيميائية باراكوات ، روتينون ، أوكسالو أسيتات وأربعة مركبات مثبطة لوسيفيراز اليراع. يمكن توسيع نطاق المنهجية لتوفير منصة لفحص مكتبات الأدوية بحثا عن مركبات قادرة على تعديل وظيفة الميتوكوندريا. غالبا ما يتم إجراء التقييم قبل السريري لسمية الدواء على خطوط الخلايا البشرية السرطانية الخالدة التي تستمد ATP في الغالب من تحلل السكر وغالبا ما تكون متسامحة مع المواد السامة للميتوكوندريا. 4،5 في المقابل ، C. ايليجانس يعتمد على الفسفرة المؤكسدة للحفاظ على التطور حتى مرحلة البلوغ ، ورسم موازية مع البشر وتوفير فرصة فريدة للتقييم المركب في السياق الفسيولوجي لكائن حي كامل متعدد الخلايا.

وقد تم الحصول على نتائج ممثلة لتوضيح طريقة لروتينون (الشكل 1)، الباراكوات (الشكل 2)، أوكسالوآسيتات (الشكل 3)، و 4 مركبات التي تم انتقاؤها مثبطات كما يراعة luciferase خلال فحص مكتبة المخدرات 13 (الشكل 4). وقد بدأ التعرض للمخدرات في المرحلة L4 في جميع الحالات، ولكن بدأت تجارب التعرض ترابل في 41 ساعة بعد الغذاء قدمت أول من الديدان الخيطية مقارنة مع 45-46 ساعة للمركبات الأخرى. بروتوكول يسمح للحصول على درجة من المرونة في اختيار الوقت المناسب للبدء من التعرض للمخدرات وطول التعرض. ينبغي التقيد ومع ذلك، لأغراض الفحص، تعيين أوقات الى المفضلة مرة واحدة، لاستنساخ بين التجارب. يجب أن تقاس النهاية من قبل 66-67 ساعة وقت التنموية من أجل منع واسعة وضع البيض والتفريخ من ذرية في الآبار. يتم توفير مبادئ توجيهية للتوقيت في Tقادرة 1. روتنون، وهو مجمع الميتوكوندريا I المانع، تخفيض تلألؤ بيولوجي بعد كل من قصيرة نسبيا (2 ساعة) وأطول التعرض (24 ساعة) لمجموعة من تركيزات (الشكل 1). في هذه الحالة، لم تتخذ أية قياسات GFP، ولكن عدد مكررات التقنية المستخدمة (ن = 6) كافية لمعادلة أية اختلافات في أرقام دودة بين الآبار 3. تعرض 24 ساعة هو نافذة الزمنية التي تنمو الديدان الخيطية، والتنمية أبطأ نتيجة معقدة I تثبيط كان من المتوقع أن تسهم في انخفاض تلألؤ بيولوجي. هذا ما أكده الملاحظة البصرية تحت المجسام مع تطوير تأخر ينظر إليها، ولا سيما في تركيزات 20 ميكرومتر وأعلاه؛ بالإضافة لوحظ بعض الفتك من 40 ميكرومتر (الملاحظات النوعية لا كميا). ولم يلاحظ أي الفتك بعد التعرض 2 ساعة ولكن ظهرت التأثيرات على حركة الدودة. انخفاض حاد في تلألؤ بيولوجي بالنسبة لضوابط occurred في أقل تركيز من روتينون اختبار 2.5 ميكرومتر، والتي الآثار لم يتم الكشف بسهولة عن طريق الملاحظة البصرية السريعة في 2 التعرض ساعة. هذا الانخفاض في تلألؤ بيولوجي يتسق مع انخفاض ATP الخلوية. وقد تحقق تثبيط القصوى بأقل تركيز روتينون المستخدمة (2.5 ميكرومتر) مشيرا إلى أن أي تجارب لاحقة تستهدف روتينون على وجه التحديد يجب أن تنفذ بين 0 و 5 ميكرومتر [نطاق تركيز 0-160 ميكرون تم اختيار كجزء من المقارنة مع أدوية أخرى حددت في البداية وجود آثار كبيرة على 10 ميكرومتر (التي سيتم نشرها في مكان آخر)]. والباراكوات مبيدات الأعشاب تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا من خلال زيادة أنواع الاكسجين التفاعلية. هنا، علينا أن نظهر تأثيرها على تلألؤ بيولوجي من C. ايليجانس السلالة PE254 بعد التعرض لمجموعة من تركيزات لمدة 24 ساعة (الشكل 2). كما سلالة يحمل لوك :: الانصهار GFP، كان GFP مضان المرضس قياس كوسيلة للتطبيع. انخفضت 6،9 ترابل تلألؤ بيولوجي، GFP مضان وتلألؤ بيولوجي تطبيع بشكل ملحوظ. وأشار الاختبار اللاحق-Dunnet أن تركيزات الباراكوات مع وجود اختلافات كبيرة فيما يتعلق السيطرة على السيارة وكانت 4 و 8 مم للتلألؤ بيولوجي وتلألؤ بيولوجي تطبيع، فضلا عن 2 ملم لتلألؤ بيولوجي تطبيع. وكان تركيز الوحيد تخفيض كبير GFP مضان 8 ملم، والتركيز على شوهدت فيها آثار للنمو ودودة الميتة عرضية (الملاحظات النوعية). كان الانخفاض في تلألؤ بيولوجي (وتلألؤ بيولوجي تطبيع) أكبر من مضان، بما يتفق مع انخفاض وظيفة الميتوكوندريا والآثار على إنتاج ATP. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​اختبارها على C. ايليجانس السلالة PE254 بتركيز واحد من 8 ملم، أدى إلى زيادة في تلألؤ بيولوجي (الشكل 3). لا GFP يتألقتم الحصول على قياسات الامتحانات التنافسية الوطنية أو إجراء الملاحظة البصرية إضافية خارج. ولكن هذه الاستجابة إلى تركيز واحد سوف تستحق المزيد من التعرض تأكيدي على مجموعة من تركيزات، وملاحظات أكثر تفصيلا من الآثار. تعزيزا لتلألؤ بيولوجي هذا المركب ليس من المستغرب كما أنها يمكن أن يفترض أن تؤدي إلى مزيد من النشاط في دورة حمض الستريك، مع زيادة في نهاية المطاف إنتاج ATP (مع ذلك سيكون من المستحسن للسيطرة على أي آثار على مستويات luciferase المراسل عن طريق تقييم GFP مضان في تجارب لاحقة). مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات أظهرت تكشف عن مدى التباين في استجابة ينظر في تجاربه التي تستند luciferase المراسل. في تجربتنا هذه التقلبات هو سمة من سمات نظام الاختبار وخاصة لظروف التعرض أقل ضررا. المركبات المثبطة يراعة luciferase DDD00001434، تم اختبار DDD0001477، DDD00000635 وDDD00023047 على حد سواء في المختبر من خلال النظر في الآثار المترتبة على بوانزيم rified والحية باستخدام C. ايليجانس لوك: GFP معربا عن سلالة. لم يكن هناك أي دليل على أن أيا من مركبات اخضعت للاختبار تسبب في وفاة الخيطية تحت ظروف التعرض. جميع المركبات 4 أثرت على luciferase النشاط في المختبر على تركيزات 2 اختبار 25 و 100 ميكرومتر (الشكل 4A). DDD00001434 قتل نشاط luciferase المراسل تنقيته تماما تقريبا، والتي قدمت لتبرير معقول لتراجع كبير في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي في (الشكل 4B). على الرغم من أن في المختبر والمقايسات فيفو لا يمكن مقارنتها مباشرة، كانت ردا على DDD00023047 مماثلة في كل من المقايسات. تسبب DDD0001477 وDDD00000635 انخفاضا أكبر في الجسم الحي مما كانت عليه في في المختبر. وقدمت هذه المركبات إلى الديدان الحية 22 ساعة قبل الركيزة وسيفيرين، ويمكن أن تعكس النتائج التي لم ينزحوا بسهولة من موقع نشط luciferase المراسل عندما أصبح وسيفيرين افاعيlable و. بدلا من ذلك، قد DDD0001477 وDDD00000635 يكون لها تأثير إضافي على مستويات ATP الخلوية. وهذا من شأنه أن يتم تقييمها بواسطة الوسائل التي لا تنطوي على يراعة luciferase. من المذكرة هو تعزيز قوي للإشارة GFP في الديدان الحية تتعرض لتفاقم DDD00000635. وسيناقش هذا أدناه. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> الشكل 1. مجمع الميتوكوندريا I المانع انخفض روتينون وضع الطاقة في C. ايليجانس مقاسا تلألؤ بيولوجي من سلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) تتعرض ل0، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80 و 160 ميكرومتر روتينون في 1٪ DMSO ل2 ساعة (قصيرة) أو 24 ساعة (التعرض الطويل) قراءات مسبقة من تلألؤ بيولوجي على التوالي في 48 و 69 ساعة من وضع دودة بعد توفير الغذاء. وأعرب تلألؤ بيولوجي (وحدة النسبية وحدات خفيفة، RLU) كنسبة مئوية من السيارة (1٪ DMSO) القيم. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية في كل تركيز روتينون (ن = 6). أسفرت عن تركيزات اختبارها في غاية الاختلاف ذات دلالة إحصائية فيما يتعلق السيطرة على السيارة (P &lt;0.001). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> الشكل 2. الباراكوات الأكسدة الضغوطات انخفضت وضع الطاقة في C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254 بطريقة تعتمد على التركيز (تقاس تلألؤ بيولوجي). المتزامنة L4 الديدان المرحلة (للراحة في هذه الحالة في 41 ساعة بعد الطعام المقدمة للL1 اليرقات) إلى 0، 0.25، 0.5، 1، 2، 4 أو 8 ملي الباراكوات لمدة 24 ساعة. وقد استخدم مضان GFP (وحدة وحدات مضان النسبية، RFU) لتطبيع البيانات تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU)، وكلاهما النهاية حصلت على 65 تنمية الموارد البشرية. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الضوابط (1٪ DMSO). أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية(ن = 5 لتركيزات مختلفة، ن = 18 للضوابط). في اتجاه واحد ANOVA: *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> الشكل 3. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​(8 ملم) تعزيز تلألؤ بيولوجي من C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) إلى طازجة 8 ملي أوكسالوآسيتات لمدة 18 ساعة ± 30 دقيقة. تم قراءة تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU) في وقت التنموي من 63.5 ساعة ± 1 ساعة وكنسبة مئوية من السيطرة على السيارة ([ده 2 O). وتمثل أعمدة مختلفة مجموعات البيانات المختلفة من 8 مكررات التقنية المخصصة لمختلف 96 لوحات جيدة داخل نفس التجربة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). 2 طريقة ANOVA مع &quot;مجموعة&quot; و &quot;تركيز&quot; كعوامل: ̵6؛ مجموعة &quot;P&gt; 0.05، &#39;&#39; ع تركيز &lt;0.001 و مصطلح التفاعل P&gt; 0.05. A <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> الرقم 4. اختبار الردود على 4 مركبات من اكتشاف المخدرات مكتبة مجمع دندي 13 (C1: DDD00001434، C2: DDD0001477، C3: DDD00000635 وC4: DDD00023047) مع النشاط المثبطة معروف على يراعة luciferase المراسل التلألؤ. (A) تأثير المركبات على نشاط تنقية يراعة luciferase (قياس وحدات خفيفة، RLU)، معبرا عنه كنسبة مئوية من السيطرة على السيارة. تم استخدام ATP تلألؤ بيولوجي CLSII مجموعة (روش، مانهايم، ألمانيا) وفقا لتعليمات بنفس كمية الانزيم luciferase المراسل aliquoted إلى الآبار (أبيض 96 ثالذراع لوحات عيار مكروي). وقدمت ATP في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر و 1 ميكرولتر من مركب (تركيز النهائي أشار) أو أضيفت DMSO (1٪). تم دمج إشارة التلألؤ لمدة 10 ثانية. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 4). تحليل: في اتجاه واحد ANOVA. * P &lt;0.05 أو *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. الاختلافات بين 25 و 100 ميكرومتر هامة للغاية لC1 (DDD00001434؛ P &lt;0.001)، وهامة لC2 و C3 (على التوالي DDD0001477 وDDD00000635؛ P &lt;0.05). (ب) في الجسم الحي قياسات تلألؤ بيولوجي، تلألؤ بيولوجي تطبيع لGFP مضان و GFP مضان من C. ايليجانس السلالة PE254 في 67 ساعة وقت التنموية بعد التعرض لمركبات الاختبار لمدة 22 ساعة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). تحليل إحصائي قامت (واحد طريقة ANOVA) للخروج على البيانات المجمعة من 3 مجموعات البيانات (3 XN = 8). * P &lt;0.05 أو *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة المعنية. مختلفاالمجال الاقتصادي الموحد بين 25 و 100 ميكرومتر فقط يعتد به إحصائيا (P &lt;0.05) للتلألؤ بيولوجي تطبيع بعد التعرض لC4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> وقت اليوم </td><td> اليوم 1 </td><td> يوم 2 </td><td> اليوم 3 </td><td> اليوم 4 </td><td> اليوم 5 </td><td> اليوم 6 </td><td> يوم 7 </td><td> اليوم 8 </td></tr><tr><td> 10/09 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 4 </td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tد&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> الخطوة 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. نظرة عامة على خطوات البروتوكول التي يتعين القيام بها في كل يوم من التجارب الخيطية (القسم 3) واقترح توقيت.

تم وصف بروتوكول للكشف في الجسم الحي عن تأثيرات مثبطات الميتوكوندريا في الكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans ولتحديد المركبات المعززة المحتملة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص مكتبات الأدوية بحثا عن مركبات تعدل وظيفة الميتوكوندريا.

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد السمية الميتوكوندريا أو التأثيرات المفيدة للأدوية باستخدام الكائن النموذجي *C. elegans*. ويتم تحقيق ذلك من خلال القياس الكمي لـ ATP في الجسم الحي في سلالات الديدان البحرية المعدلة وراثياً والتي تعبر عن إنزيم لوسيفيراز اليراعات المدمج مع البروتين الفلوري الأخضر.يمنح الجين الاندماجي خاصيتين متميزتين للديدان الخيطية. الأولى هي أنه عند تزويدها بمادة الركيزة Lucifer، تطلق الديدان الخيطية ضوءاً في النطاق المرئي بما يتناسب مع احتياطيات A TP الخلوية لديها. والثانية هي أنها عند إضاءتها بطول الموجة المناسب، ستظهر فلورية خضراء قوية.لا يعتمد الفلورة على مستويات TP في الديدان الخيطية، بل يتناسب طردياً مع كتلتها أو أعدادها. وبناءً على ذلك، يمكن استخدامه لمعايرة قياسات التلألؤ البيولوجي. خلال مقايسة نمطية، يتم تنمية مجموعة من الديدان المتزامنة نموياً حتى تصل إلى المرحلة اليرقية L four.تُعالج الديدان الخيطية بعد ذلك بمركبات الأدوية المختبرة لفترة زمنية محددة قبل قياس كل من الفلورة والتلألؤ البيولوجي. وتُظهر النتائج السمية المحتملة للدواء. وعندما ينخفض التلألؤ البيولوجي، فإن الإشارة المعززة تشير إلى وجود مركب واعد (hit) لإجراء المزيد من الاختبارات حول التأثيرات المفيدة على وظيفة الميتوكوندريا.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل فحص الأدوية على الخلايا المستزرعة، في أن الفحص يتم في السياق الفسيولوجي لكائن حي كامل متعدد الخلايا يتشارك في ما يقرب من 50% من الجينات المتعلقة بطب العيون مع البشر. ومثل البشر، تتطلب الأناقة في الواقع فسفرة تأكسدية ميتوكوندرية للنمو إلى مرحلة البلوغ، كما تشترك ميتوكوندريا هذا الكائن مع ميتوكوندريا الثدييات في العديد من الخصائص من حيث البنية والوظيفة والطاقة الحيوية. تشمل المعايير الحرجة في البروتوكول المرحلة النمائية التي يبدأ عندها التعرض، ومدة تعرض الدودة للدوء المستهدف، ووضع عدد مماثل من الديدان في كل بئر، وبالطبع تجنب التلوث. في اليوم الأول، وتحت ظروف معقمة، يتم نقل الديدان من طبق نمو ديدان بقطر 6 سم يحتوي على 2 mL من الوسط الكامل S إلى دورق يحتوي على 30 g/L من بكتيريا e coli.وسط S الكامل مع OP 50، ثم يتم تحضين القارورة مع الرج. في اليوم الرابع، يتم تبييض مستنبت الديدان الخيطية GR لحصاد البيض ومزامنة تعداد الديدان. بعد ذلك، يتم تحضين البيض طوال الليل في قارورة زجاجية تحتوي على 15 milliliters من وسط S الكامل مع الرج. وفي اليوم التالي، أي اليوم الخامس، ستكون الديدان الخيطية في نفس مرحلة النمو. ولتحديد عدد الديدان التي فقست، يتم نقل ثلاث حصص مقدار كل منها 100 µL من الديدان الخيطية، باستخدام طرف ماصة نظيف في كل مرة، إلى أنابيب دقيقة منفصلة تحتوي على 900 µL من الوسط المكمل بـ 0.01% tween 20، مع السحب والضخ بالماصة عدة مرات لتحرير أي ديدان ملتصقة بطرف الماصة.بعد ذلك، قم بعدّ النيماتودا في أربع قطرات منفصلة بحجم 10 µL من كل أنبوب من أنابيب التخفيف الثلاثة، واحسب حجم معلق النيماتودا المطلوب لإعداد مستنبتين بحجم 20 mL بحيث تحتوي كل منهما على 10 نيماتودا لكل 10 µL، ثم صب الأحجام التقريبية في أنبوبين مخروطيين سعة 15 mL موزونين مسبقاً. زن الأنابيب لتحديد الحجم الفعلي الذي تم صبه. ثم لضبط الأحجام المستهدفة، قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس بلطف وأزل الحجم الزائد.الآن، اغسل النيماتودا في إجمالي 14 milliliters من وسط S الكامل الطازج لكل أنبوبة، وأعد تعليق الرواسب في خمسة milliliters من وسط S الكامل مع 30 grams per liter من equali. OP 50. انقل النيماتودا إلى دوارق زجاجية مخروطية تحتوي على 15 milliliters من وسط S الكامل مع 30 grams per liter من equali.أضف OP 50 حتى يصل الحجم الكلي إلى 20 milliliters لكل دورق وسجّل وقت التغذية. احسب متوسط عدد النيماتودا في تسع قطرات بحجم 10 microliter للتأكد من تخفيف المزارع إلى 10 نيماتودا لكل 10 microliters. ضع المزارع في الحاضنة لمدة تتراوح من 42 إلى 44 ساعة.في اليوم السابع، اسحب مستنبتات الديدان الخيطية إلى قارورة واحدة مع التحريك اللطيف والمستمر. ثم انقل حصصاً مقدارها 3-4 مل من الديدان الخيطية إلى حوض معقم واحد سعة 60 مل. استخدم ماصة ثمانية القنوات لإضافة 25 µL من الديدان الخيطية المعلقة لكل بئر في طبق 96 بئراً.استخدم ألواح معايرة دقيقة سوداء ذات قيعان مسطحة وشفافة. ثم أعد الأغطية إلى الألواح وضع الألواح جانباً. وفي كل مرة يتم فيها استزراع لوحين، انقل حصتين إضافيتين من النيماتودا بحجم 2.5 milliliter إلى الحوض لتعويض الحجم المفقود.بعد استزراع 13 إلى 14 طبقاً بالديدان الخيطية (nematodes)، أضف 74 µL من الوسط الغذائي الكامل S إلى كل بئر، وانقل الأطباق إلى غرفة رطبة وحاضنة هزازة حتى يحين موعد إعطاء الدواء، مع استمرار هز الأطباق. قم بإذابة 2 من أطباق الأدوية ذات الـ 96 بئراً الملحومة (weld drug plates) المخصصة للفحص. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات مع تغيير الرؤوس في كل مرة.انقل ميكرولتر واحد من العمود الأول في لوحة العقاقير الأولى إلى الأعمدة من واحد إلى خمسة في لوحة الديدان الخيطية. ثم انقل ميكرولتر آخر من العمود الثاني في لوحة العقاقير إلى الأعمدة من ثمانية إلى 12 في لوحة الديدان الخيطية. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من المادة الناقلة إلى العمودين السادس والسابع من لوحة الديدان الخيطية.استخدم الأعمدة المتبقية في لوحة الدواء لمعالجة بقية أطباق النيماتودا بنفس الطريقة، مع التأكد من تضمين طبقين تمت معالجتهما بالناقل فقط أيضاً. ثم أعد جميع الأطباق إلى الغرف الرطبة في الحاضنة الهزازة لمدة تتراوح بين 20 إلى 22 ساعة أخرى في اليوم الثامن. ولتحضير طبق تحكم خلفي لقراءات الفلورية، اجمع محتويات الآبار من طبق نيماتودا تمت معالجته بالناقل فقط واترك النيماتودا تترسب لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.بعد ذلك، يتم جمع البكتيريا التي تحتوي على snat وتحميل عينات بحجم 100 microliter في كل بئر من آبار لوحة ميكروية سوداء ذات قاع شفاف. يتم فحص اللوحة تحت المجهر، وتحديد الآبار التي تظهر فيها الديدان الخيطية لاستبعاد هذه الآبار من تقدير الخلفية الفلورية. وأخيراً، يتم قياس الفلورية لتحديد درجة التلألؤ البيولوجي لكل لوحة.وبدورها، قم بتوزيع 50 µL من منظم التألق freshly prepared على كل بئر، ثم ضع الطبق على منصة هزازة وابدأ تشغيل المؤقت بعد ثلاث دقائق. اقرأ مستوى التألق بمعدل ثانية واحدة لكل قياس. وفي هذه التجربة التمثيلية الأولى، أدى استخدام مثبط معروف للمركب الميتوكوندري الأول إلى تقليل مخرجات الضوء لدى الديدان الخيطية بعد فترات تعرض قصيرة وطويلة نسبيًا وبمجموعة من التركيزات.في هذه التجربة، تبيّن أن مبيد الأعشاب باراكوات (paraquat) يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في فلورة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المضيء حيويًا والوميض الحيوي المعياري لسلالة C PE 2 54. علاوة على ذلك، كان انخفاض الوميض الحيوي أكبر من انخفاض الفلورة، وهو ما يتفق مع التأثيرات المعروفة للعقار في خفض وظائف الميتوكوندريا وتقليل إنتاج الـ ATP. يوضح هذا الرسم البياني مثالاً لمركب يعزز الوميض الحيوي في الديدان الخيطية، وهو وسيط دورة حمض الستريك أوكسالوأسيتات (oxaloacetate) بتركيز واحد قدره 8 millimolar.لاحظ أن التباين التجريبي الملحوظ بين هذه التشغيلات المكررة ليس أمراً غير معتاد في التجارب القائمة على لوسيفيراز. هنا، لوحظ أن المركبات المثبطة للوسيفيراز الخاص بـ Firefly تؤثر على نشاط اللوسيفيراز في المختبر عند تركيز 25 micromolar و 100 micromolar، مع تخميد شبه كامل للنشاط بواسطة مركب DDD. 1, 4 3 4، ورغم عدم إمكانية المقارنة المباشرة، فقد لوحظ أيضاً انخفاض كبير في التألق الحيوي بعد المعالجة بمركب تثبيط اللوسيفيراز في الجسم الحي.إثبات أن التغيرات في التألق الحيوي قد تنتج عن تأثير مثبطات إنزيم لوسيفيراز بدلاً من التغيرات في مستويات ATP في الجسم الحي. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراعاة أن المركبات يمكن أن تؤثر على نشاط إنزيم لوسيفيراز الخاص باليراعات بشكل مباشر بدلاً من التأثير على حالة الطاقة في الدودة. وبناءً على ذلك، يمكن التحقق من صحة النتائج باستخدام تقنيات متعددة لتقييم الوظيفة الميتوكوندرية، مثل، على سبيل المثال، تحديد استهلاك الأكسجين، أو تحديد جهد الغشاء الميتوكوندري، أو تحديد أنواع الأكسجين التفاعلية، أو تصوير الميتوكوندريا في سلالات *C. elegans*.الميتوكوندريا، مع وسم GFP.

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

إجراءات لبناء زراعة السائل...

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

المصدر: أندرسون ، كيو إل وآخرون. نظام C. elegans Pathosystem عالي الإنتاجية وعالي المحتوى وقائم على السائل. J. Vis. خبرة. (2018)يوضح هذا الفيديو طريقة فحص عالية الإنتاجية باستخدام Caenorhabditis elegans لدراسة ضربات قاضية للجينات أثناء تفاعلات المضيف والعامل الممرض. يحدد إجراء تحضير الديدان القاضية ونقلها إلى ألواح الفحص لتقييم آثار قتل الديدان التي يسببها مسببات الأمراض.

اختبار سائل متعدد الآبار لفحص C. ايليجانس الضربة القاضية

يوضح هذا الفيديو فحصا في الجسم الحي لدراسة الانقسام في Caenorhabditis elegans. عند تعريض الديدان الخيطية لدواء محفز للانقسام ، يتم تقييم حدوث الانقسام عن طريق التوطين المشترك بين DCT-1 ، وهو مستقبل انقسام على الميتوكوندريا التالفة ، وبروتين الغشاء الذاتي LGG-1.

فحص في الجسم الحي للكشف عن الانقسام في الديدان الخيطية المعدلة وراثيا

مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة...

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

ظهر مؤخرا  التكاثر الشبيه بالبريون لمجاميع البروتين على أنه متورط في العديد من الأمراض التنكسية العصبية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف كيفية استخدام الديدان الخيطية C. ايليجانس كنظام نموذجي لمراقبة انتشار البروتين والتحقيق في الظواهر الشبيهة بالبريون.

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em

المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير.

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

ميتوفاجي، عملية إزالة تلف الميتوكوندريا، أمر ضروري لصيانة التوازن والصحة المتقدرية. تقدم هذه المقالة بعض ميتوفاجي أحدث أساليب الكشف في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيسوالفئران.

في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لسرعة إنتاج مئات من وسائط النمو السلكية أجار، لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة من ايليجانس كاينورهابديتيس لكل بئر. هذه الثقافات مفيدة لفحص الكائنات كله المظهرية. نحن نركز هنا على استخدام هذه الثقافات إلى شاشة المواد الكيميائية للآثار المؤيدة طول العمر.

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لنهجين شبه آليين لتحليل النشاط الحركي في C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms ، وهما ZebraLab (وهو مقايسة متوسطة الإنتاجية) وWormScan (وهو مقايسة عالية الإنتاجية) وتوفر تحليلا مقارنا بين مجموعة واسعة من طرق البحث لتحديد سلوك النيماتودا والوظيفة العصبية العضلية المتكاملة.

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

قد تؤثر ميكروبات الأمعاء بشكل إيجابي أو سلبي على صحة مضيفها من خلال آليات محددة أو محفوظة. Caenorhabditis elegans هي منصة ملائمة لفحص مثل هذه الميكروبات. يصف البروتوكول الحالي الفحص عالي الإنتاجية ل 48 عزلة بكتيرية للتأثير على مقاومة إجهاد الديدان الخيطية ، ويستخدم كبديل لصحة الديدان.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

يوفر هذا البروتوكول نهجا موحدا لتصوير مورفولوجيا الميتوكوندريا في أنسجة متعددة من C. ايليجانس أثناء الشيخوخة.

تصوير وقياس مورفولوجيا الميتوكوندريا في C. ايليجانس أثناء الشيخوخة

تعلم كيفية الكشف عن تثبيط الميتوكوندريا في الكائنات الحية باستخدام Caenorhabditis elegans المعدل وراثياً. يتيح هذا البروتوكول فحص مكتبات الأدوية لتحديد المركبات التي تؤثر على وظائف الميتوكوندريا.

A للمسح في فيفو الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية انواع معينة ايليجانس (فيديو) | JoVE Journal

A للمسح

استكشف المزيد من الفيديوهات