Microenvironments-شطيرة مثل لتسخير خلية / المواد التفاعلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميع الشطيرة مثل الثقافات من أجل دراسة سلوك الخلية في بيئة ثلاثية الأبعاد أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير وطلاء الركائز البطنية والظهرية أولا ببروتينات مثل الفيبرونكتين. بعد ذلك ، تجلس الخلايا على غرار ثقافة ثنائية الأبعاد القياسية.

ثم يتم تراكب الركيزة الظهرية بحيث يتم تحفيز الخلايا بطنيا وظهريا. أخيرا ، يمكن إجراء تجارب مثل اختبار التئام الجروح. في النهاية ، يتم تحليل الثقافات الشبيهة بالساندويتشات من خلال الإجراءات التي تم تطويرها بالفعل للثقافات ثنائية الأبعاد القياسية ، مثل التصوير الحي أو التألق المناعي أو الاستخراج الخلوي.

لمزيد من التحليل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية الثقافية على الأنظمة ثلاثية الأبعاد الحالية هي أنها سمحت بدراسة المعلمات المختلفة في التفاعلات المادية مثل التضاريس والكيمياء والصلابة ومحتويات البروتين في كل من المواقع البطنية والظهرية التي توفر درجة عالية من التنوع. إلى جانب الإجراءات التجريبية التي يمكن إعاقتها لبعض الأنظمة ثلاثية الأبعاد مثل الليبين والتألق المناعي والاستخراج الخلوي يتم تنفيذها بسهولة لإنتاج طبقة مسطحة من حمض polylactic أو PLLA عن طريق صب المذيبات التي تعمل في غطاء الدخان ، أضف جرامين من PLLA إلى 100 مل من الكلوروفورم وحركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات تقريبا أو حتى تذوب تماما.

ضع غسالات من الفولاذ المقاوم للصدأ على طبق بتري زجاجي. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول PLLA إلى الغسالات. استخدم ورق الألمنيوم مع بعض الثقوب لتغطية الطبق واترك PLLA يتبخر ببطء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتسخين العينات على حرارة 120 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتبخر أي آثار للمذيب. ثم بعد السماح للعينات بالتبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا ، استخدم 18.2 ميجا أوم من الماء لتغطية العينات في الطبق واحتضان درجة حرارة الغرفة لمدة ثماني دقائق. بعد الحضانة ، استخدم شفرة حلاقة لتقشير الغسالات من طبق بتري.

ثم استخدم الملقط لإزالة أي عيوب من حافة الغسالات واترك العينات تجف في الهواء. نظرا لأن PLLA قابل للتحلل عن طريق مخزن التحلل المائي ، فإن العينات في فراغ تجف حتى يوم التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج ألياف ELLA وفقا لبروتوكول النص واستخدامها كركيزة ظهرية تحت غطاء ثقافة معقم.

أضف 20 ميكروغراما لكل مليلتر من FI nin في docos PBS أو DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم إلى العينات ودرجة حرارة الغرفة المحتضنة لمدة ساعة واحدة بعد طلاء البروتين. استخدم DPBS لغسل العينات مرتين وتخزينها في DPBS مع الفوسيرة والكالسيوم والمغنيسيوم حتى تصبح جاهزة لاستخدام خلايا البذور التالية على زلات الغطاء الزجاجي وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق بالركيزة البطنية. ثم انقل العينات إلى آبار جديدة من صفيحة 12 بئر.

باستخدام الملقط ، قم بتراكب الركيزة الظهرية بعناية على الخلايا. ثم أضف ملليلتر واحد من المتوسط. سيمنع وزن الغسالة الركيزة الظهرية من الطفو.

أعد العينات إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وقم بتغيير الوسط مرتين في الأسبوع لدراسة هجرة الخلايا داخل الشطيرة مثل المزرعة. بعد طلاء الركائز البطنية والظهرية بالفبرونيكتين كما هو موضح سابقا ، تنزلق خلايا البذور على الغطاء الزجاجي بكثافة عالية ، وتحتضن العينات وتسمح للخلايا بتحقيق التقاء. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة لخدش الطبقة الأحادية للخلية من أجل إنشاء مجموعتين من الخلايا مفصولة بفجوة.

ضع الركيزة البطنية الجالسة في بئر جديد مناسب لاكتساب الفاصل الزمني وكبير بما يكفي لتناسب الركائز الظهرية بالداخل. ثم باستخدام الملقط كما هو موضح سابقا ، قم بتراكب الركيزة الظهرية على الخلايا وأعد تعبئتها بالوسط. ضع العينة تحت مجهر الفاصل الزمني والتقط صورا لإغلاق الفجوة كل 20 دقيقة.

استخدم برامج مثل mito BO من الصورة J لتحليل إغلاق الفجوة في الساندويتش. مثل الثقافة. تعتمد الكبريتات بشكل كبير على الوقت الذي يتم فيه تحفيز المستقبلات الظهرية وخصائص التفاعل الظهري.

على غرار الأنظمة ثلاثية الأبعاد الأخرى مثل الهلاميات المائية ، على سبيل المثال ، كما هو موضح هنا ، فإن ألياف PLLA الظهرية المغزولة الكهربائية مباشرة محاذاة الخلية عند تغطيتها بالألياف الفيبرونكتين ، ولكن ليس عند تغطيتها ببروتين غير لاصق مثل BSA. بالإضافة إلى ذلك ، أدت الشطيرة الشبيهة بالثقافات ذات PLLA الظهري العادي إلى زيادة مستوى تكوين العضل باستخدام خلايا C اثنين من خلايا C 12. هذا يعتمد أيضا على المحفزات البيولوجية الظهرية.

نظرا لأن التفاعل مع البروتينات الظهرية المختلفة ينتج عنه معدلات تمايز مميزة كما هو موضح في هذا الفيديو ، فإن الخلايا الليفية التي تهاجر داخل الساندويتش مثل الثقافة في مقايسة التئام الجروح ، تتبنى مورفولوجيا ممدودة وتهاجر لمسافات أقصر مقارنة بالخلايا. مستزرعة على ركائز ثنائية الأبعاد مشابهة للفيبرونيكتين ثلاثي الأبعاد والمواد الهلامية الكولاجينية. ساندويتش مثل الاستزراع يزيد من إعادة تنظيم ECM بوساطة الخلية مقارنة بظروف 2D.

تعتمد هذه العملية على المحفزات الميكانيكية الظهرية واستقرار الهيكل الخلوي. نظرا لأن استخدام مثبطات الانقباض مثل BLEs ، أعاق الستاتين العملية S حسنا ، لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية تجميع الساندويتش مثل الثقافات. يمكن لهذه الطريقة هندسة 3D مثل البيئة المكروية للطب المتفاعل والسرطان ، بما في ذلك التطبيقات في نماذج الأمراض ودراسات التطوير واختبار الأدوية.