July 12th, 2015
هنا نصف طريقة بسيطة لعزل الخلايا السطحية الظهارية للقولون الفئران المتميزة مكانيا عن خلايا قاعدة السربات الأساسية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التشريح الدقيق لمنطقتين متميزتين مكانيا من القولون ، ومنطقة سرداب K التكاثرية ، والخلايا الظهارية السطحية المتمايزة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة القولون الماوس أولا. الخطوة الثانية هي تجميد الأنسجة بين لوحين معدنيين.
بعد ذلك ، يتم تثبيت الأنسجة على كتلة OCT مستوية مسبقا. الخطوة الأخيرة هي تقسيم الأنسجة على ناظم البرد على فترات 10 ميكرون. في النهاية ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أو اللطخة الغربية لإظهار التغيرات في التعبير الجيني والبروتيني.
ميزة تقنيتنا هي أنها سريعة وغير مكلفة وعالية الإنتاجية. إجراءاتنا هو كريستيان غارنر شميدت ، فني في مجموعتنا. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تستخدم والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة إيموري ، وتم إجراؤها وفقا لمعايير المعاهد الوطنية للصحة.
بعد إعداد ناظم التبريد ، كالعادة ، قم بموازنة شفرات وخراطيش ناظم البرد إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر. ثم املأ قالب التبريد الفارغ بمركب درجة حرارة القطع الأمثل وقم بالتوازن إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر. سيستغرق هذا حوالي 30 دقيقة.
قم بإزالة OCT المجمد من القالب وثبته في ظرف الظرف باستخدام OCT السائل. ضع الظرف في ذراع microtome واترك OCT يتماسك لمدة 10 دقائق. اضبط ناظم البرد على 10 ميكرون لكل قسم وحلق كتلة OCT حتى تصبح مسطحة للخلف ، بعيدا عن الشفرة بعدة سنتيمترات.
بعد ذلك ، قم بإعداد شفرات حلاقة لكل عينة باستخدام ملف معدني ، مما يؤدي إلى إضعاف الحافة الحادة للشفرات. ثم قم بإزالة شفة الألومنيوم بالملقط. قم بإعداد طبق زراعة الأنسجة بطول 10 سم ، 50٪ مملوء بالسيليكون ، ومع 10 إلى 15 دبابيس تشريح.
أضف خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزين العازلة إلى الطبق بعد القتل الرحيم للفأر وفقا للطرق المعتمدة واستئصال جزء من القولون البعيد بين صفر وستة سنتيمترات من فتحة الشرج. استخدم المقص للقطع. افتح القولون طوليا وأزل محتويات البراز.
قم بتثبيت الأنسجة على طبق تشريح السيليكون الذي يحتوي على عازلة هانك بحيث يكون سطح الغشاء المخاطي متجها لأعلى. مد الأنسجة باستخدام دبابيس التشريح. ثم اتركه يرتاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الطيات من الأنسجة والسماح لطبقات العضلات بالاسترخاء.
يعمل بعد استراحة الأنسجة ، ويزيل جميع المسامير باستثناء النهاية. حرك شفرة الحلاقة أسفل القسم المطلوب من الأنسجة ، ثم اسكب المخزن المؤقت للهانك. أضف شفرة حلاقة أخرى إلى الأعلى لصنع شطيرة.
قطع جزء الأنسجة وإزالة دبابيس النهاية. انقل شطيرة مناديل شفرة الحلاقة إلى الثلج الجاف. اترك الأنسجة تتجمد لمدة خمس إلى 10 دقائق.
التقط شطيرة مناديل الحلاقة واتركها تسخن قليلا عن طريق وضع إصبعك على الشفرة العلوية. افصل الساندويتش وقطع حول حواف قطعة الأنسجة. قطع جزء من الأنسجة حوالي 0.5 سم في سنتيمتر واحد.
اترك الأنسجة تدفئ حتى يبدأ الجليد الموجود فوق الأنسجة في الذوبان. في هذه المرحلة ، اضغط بسرعة وبعناية على الأنسجة في كتلة OCT. في ناظم البرد ضع إصبعا فوق العينة.
سيسمح لك نقل الحرارة بإزالة الشفرة دون تعطيل الأنسجة. قم بتغطية الأنسجة ب OCT واتركها تتوازن لمدة خمس دقائق. ثم قطع الأقسام عند 10 ميكرون.
ضع الأقسام على شريحة وافحص الأقسام بصريا حتى يتم رؤية الخبايا. ضع الأقسام في أنابيب سعة 1.5 مليلتر أو على الشرائح. تظهر هذه الصورة أنسجة القولون الملطخة بالهيماتين في المقطع العرضي التقليدي مع العضلات الدائرية المسماة سم.
الغشاء المخاطي العضلي المسمى MM تظهر بوضوح الخلايا الأساسية للسرداب والخلايا الانتقالية والخلايا السطحية. تظهر هذه الصورة العضلات الدائرية بعد التقسيم التسلسلي. بينما نمضي قدما نحو الخلايا السطحية ، يظهر الغشاء المخاطي العضلي.
تظهر هذه الصورة خلايا قاعدة التشفير الملطخة h و D بتكبير أعلى. لاحظ عدم وجود تجويف مركزي. هنا ، تظهر الخلايا الانتقالية وتظهر هذه الصورة الخلايا السطحية.
تظهر الصور التالية تلطيخا مناعيا فلورية لتلطيخ خبايا القولون المعزولة لبروتين تقاطع الخلية إلى الخلية. يظهر [سولا] [إكلودين] واحدة أو [زو] واحدة خضراء ونواة, أي يظهر أزرق لاحظت في المقطع عرضي. تظهر الخلايا الانتقالية والسطحية هنا بعد التقسيم التسلسلي.
يتم التعبير عن العديد من عوامل التمايز بطريقة زمانية مكانية على طول محور سطح cryp. يتضمن ذلك عامل النسخ الشلل مثل العامل الرابع الموضح باللون الأخضر ، والذي يتم إثرائه في مجموعات الخلايا السطحية عند عرضه في المقطع التسلسلي يسمح بتقييم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لمستويات KLF الأربعة mRNA بين الأجزاء الثلاث. أخيرا ، توضح هذه اللطخة الغربية مستويات بروتين KLA الأربعة في مجموعات الخلايا هذه.
لا تنس أن العمل باستخدام شفرات ميكروتون يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا كن حذرا للغاية عند إجراء هذا الإجراء.
تصف هذه المقالة طريقة لعزل الخلايا السطحية الظهارية القولونية الفأرية المميزة مكانيًا من الخلايا الأساسية للغشاء المخاطي. تسمح التقنية بتشريح القولون إلى منطقتين: منطقة K الخاصة بالتشريب التكاثُري وخلايا الظهارة السطحية المتمايزة.
Spatially resolved microdissection of murine colonic mucosa enables precise isolation of proliferative crypt and differentiated surface epithelial cell populations for molecular analysis. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in gastrointestinal disease models, enhancing predictive confidence in early discovery and translational research. The method's efficiency and yield facilitate robust portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
This cryosectioning and microdissection method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling compartment-specific molecular analysis from early hypothesis testing through translational validation.