Name: الطريقة Cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: تعلم تقنية التقطيع المجهري للأنسجة المجمدة لعزل خلايا الظهارة القولونية في الفئران. تتيح هذه الطريقة السريعة والاقتصادية دراسة التعبير الجيني والبروتيني بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (DK55679 ، و DK59888 إلى A.N.). الفحص المجهري الخلوي المتكامل بجامعة إيموري الأساسية لمنحة مركز السرطان الشامل لمعهد وينشيب للسرطان ، P30CA138292 ، وجائزة التطوير الوظيفي لمؤسسة كرون والتهاب القولون الأمريكية إلى CTC وجائزة الزمالة إلى A.E.F.

تجارب استخدمت C57BL / 6 الفئران بين 10 و 12 أسبوعا من العمر. تم استعراض جميع الإجراءات باستخدام الحيوانات التي وافقت عليها لجنة جامعة إيموري المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام وتم إجراء فقا لالمعاهد الوطنية للمعايير الصحية. 1. الإعداد التجريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ناظم البرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن ناظم البرد إلى -20 ° C، بما في ذلك شفرة مشراح وخراطيش (ممارسة الحذر الشديد في جميع أنحاء شفرة!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء cryomold فارغ أكتوبر (الأمثل مركب قطع درجة الحرارة) وتتوازن إلى -20 ° C (~ 30 دقيقة). إزالة أكتوبر المجمدة من العفن وإصلاحه على لتشاك مع السائل أكتوبر وضع كتلة / تشوك في الذراع مشراح والسماح للأكتوبر لضبط لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ناظم البرد إلى 10 ميكرون لكل قسم ويحلق كتلة أكتوبر حتى أنها مسطحة. دعم ذراع مشراح بعيدا عن شفرة من قبل عدة سنتيمترات. في هذه المرحلة لا ضبط شفرة أو ظرف للفترة المتبقية من والخبيرiment. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شفرات الحلاقة: إعداد 2 شفرات الحلاقة في العينة. باستخدام ملف المعدنية، مملة حافة sharped من ريش. المقبل، وإزالة شفة الألومنيوم مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البرد طبق بيركس أو أي سطح مستو على الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق تشريح مع 10-15 دبابيس تشريح. وهناك صحن 10 سم زراعة الأنسجة 50٪ مليئة السيليكون تكفي. إضافة 5 مل من العازلة هانكس في RT. </li></ol> 2. تشريح القاصي القولون الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الفئران في غرفة مغلقة والموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين وخلع عنق الرحم، ثم رش 70٪ من الإيثانول على 12 البطن والصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير في جلد البطن مع مقص ومن ثم إجراء شق لكشف التجويف البريتوني. ويمكن الاطلاع على إجراءات مماثلة وصفها هنا 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأمعاء الغليظة على حافة الشرج وندف بعيدا مساريق حتى القولون مجانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال القولون القاصيالجزء بين 0 و 6 سم من فتحة الشرج. هنا، وعمق سرداب هو ~ 150 ميكرون (انظر الشكل 1B). خفض فتح القولون باستخدام مقص طوليا وإزالة محتويات البراز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الأنسجة إلى الطبق تشريح مع سطح الغشاء المخاطي مواجهة. تمتد النسيج باستخدام دبابيس تشريح على طبق السيليكون في المخزن هانكس وترك الباقي لمدة 10 دقيقة في RT (الشكل 1C). هذا يزيل طيات من الأنسجة ويسمح للطبقات العضلات على الاسترخاء. </li></ol> 3. جبل الأنسجة على ناظم البرد لباجتزاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرر شفرة حلاقة تحت القسم المطلوب من الأنسجة ومن ثم تخلصي من عازلة هانكس. إضافة شفرة حلاقة أخرى إلى الأعلى، مما يجعل شطيرة. قطع الجزء الأنسجة وإزالة المسامير. نقل شطيرة شفرة حلاقة / الأنسجة إلى الثلج الجاف. السماح للأنسجة لتجميد (5-10 دقيقة، 1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الحلاقة / شطيرة الأنسجة والسماح لها دافئ قليلا من خلال وضع الاصبع على BL الأعلىADE (الجانب المخاطية يصل، وهذا يوجه النسيج بحيث يتم مقطوع طبقات العضلات القاعدية أولا). فصل ساندويتش وخفض حول حواف الجزء الأنسجة. قطع شريحة الأنسجة حوالي 0.5 سم × 1 سم. المناطق حافة لديهم ميل إلى حليقة، مما تسبب في مسلسل أقسام تحتوي على العديد من طبقات الأنسجة. لاحظ أن الإفراط في قطع هو أفضل من دون قطع، لذلك يتجه الى جانب الحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأنسجة لتدفئة حتى يبدأ الجليد على قمة الأنسجة في الذوبان. في هذه المرحلة بسرعة وبدقة الضغط على الأنسجة في كتلة أكتوبر في ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شفرة من خلال وضع الاصبع على العينة. ونقل الحرارة يسمح لك لإزالة شفرة دون تعطيل الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف النسيج مع أكتوبر ويوازن لمدة 5 دقائق. قطع المقاطع في 10 ميكرون (الشكل 1E، F). تفقد البصر الأقسام حتى ينظر الخبايا. أقسام مكان في 1.5 مل أنابيب أو على الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل مرنا أو البروتين، مكان رانه العينات في الأنابيب مع 5 سرداب قاعدة، 5 الانتقالي، و 5 أقسام السطح في أنبوب. لجمع RNA إضافة 1 مل العزلة كاشف التجاري واحتضانها في RT لمدة 10 دقيقة. أداء تنقية RNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 5-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لتوليد كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنقية البروتين، إضافة 0.5 مل من RIPA الباردة العازلة تحلل (بالإضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني) في 5 أقسام. يصوتن 3 مرات في دورة 70٪، على الجليد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينات SDS العازلة تحميل الصفحة (العازلة Laemmli)، واحتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. العينات الخاضعة للSDS PAGE ونقلها، ثم يعثرا في الحليب 5٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة. إجراء تحليل لطخة غربية تليها الحضانة مع الأجسام المضادة KLF4 (1: 500) O / N عند 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
<li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li>
<li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+is+it+really+just+another+break+in+the+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li>
<li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li>
<li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192(2011).</li>
<li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li>
<li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li>
<li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li>
<li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li>
<li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

غير مفهومة الآليات الجزيئية المشاركة في القولون تكاثر الخلايا الظهارية والتمايز. وهذا يشمل فجوات في فهمنا للبيئة الإشارات الخلوية من مقصورة الخلايا الجذعية في قاعدة الخبايا الظهارية القولون. وهناك أيضا اهتمام متزايد في العمليات التي تكمن وراء خلية معوية التمايز. على سبيل المثال، زيادة مطلوب فهم في الجسم الحي التمايز كمقياس للدراسات تهدف الى انتاج في المختبر أنظمة المعوية الابتدائية 16. يحتوي الإجراء أعلاه العديد من الخطوات التي تتطلب المزيد من الاهتمام. أولا، وإزالة الحواف حول قطاع الأنسجة المجمدة (كما هو مبين في القسم 3.2) مطلوب كما حواف الأنسجة حليقة أثناء تشريح والتجمد. الفشل في نقل هذه النتائج حواف هو يسكنها خليط من الخلايا السطحية وقاعدة سرداب. تركيب الأنسجة على قبل المبردة، أكتوبر كتلة تعادل الضروري أيضا. تيبروتوكول له يمكن أن تتكيف مع مناطق أخرى من القولون البعيدة عن طريق تغيير عدد من المقاطع في كل تجمع. على سبيل المثال، كما هو مبين في الشكل 1B، المخاطية طول سرداب يتراوح بين 150-300 ميكرون. لذا، عند دراسة المنطقة الواقعة بين 4 سم 6 سم من فتحة الشرج، ينبغي زيادة عدد الفروع من 15 إلى 30. الأهم من ذلك، لا اقترح هذا البروتوكول لالقولون الداني (7 سم 9 سم) وذلك بسبب طيات ( الثنيات المائلة) التي تمتد إلى التجويف مما يجعل من المستحيل خلايا منفصلة السطحية وسرداب قاعدة من قبل باجتزاء المسلسل. وقد استخدمت تقنيات باجتزاء مسلسل لدراسة سرداب قاعدة وسطح السكان الخلايا الظهارية في البشر. ومع ذلك، لدينا بروتوكول يضيف خطوات إضافية مطلوبة نظرا لصغر حجم أنسجة الفئران. نقترح أن البروتوكول المذكور أعلاه سيسمح للتحقيق في سرداب قاعدة والسكان الخلايا الظهارية السطحية في أنظمة الماوس لين العريكة وراثيا. في الواقع، yie أقسام المجمعةدينار بروتين عالي الجودة وRNA تحليل المصب مناسبة. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية دراسة مسارات الإشارات الخلوية أو لونين مناعي. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه، مثل العديد من الطرق البديلة المذكورة أعلاه، تحتوي على أقسام أدى مزيج من الخلايا الظهارية الصفيحة المخصوصة والخلالي. في الختام، بروتوكول الموصوفة هنا يوفر، طريقة العائد المرتفع السريع لتحليل العمليات الجزيئية في مناطق مختلفة مكانيا من الغشاء المخاطي للقولون الفئران.

بطانة القولون الظهارية هي الأنسجة التجدد للغاية، مع الخلايا الجذعية المقيمة تجديد الأنسجة كل بضعة أيام 1. هذه عملية تجديد تتطلب الحفاظ على التكاثري مقصورة الخلايا الجذعية. مع مرور الوقت، فإن الخلايا ابنة المنتجة حديثا تفقد إمكانية التكاثري، وتهاجر نحو السطح اللمعية من الأمعاء. تتزامن مع الهجرة، الخلايا الاصلية تفرق في المعوية لتشكيل حاجز ناضجة أو الخلايا المنتجة للكأس المخاطية. ويعتقد أن فشل هذا البرنامج التمايز للمساهمة في خطر حاجز الظهارية مثل ما لوحظ في مرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون 2،3. سوف دراسة مفصلة عن العمليات المذكورة أعلاه تتطلب منهجيات لعزل سرداب قاعدة والخلايا السطحية السكان. توجد أساليب متعددة، ولكل منها مزايا وعيوب فريدة من نوعها. الأساليب الحالية لعزل الخلايا الظهارية في الأمعاء تشمل الفصلوكلاء الإنتشاء والبراءة الميكانيكية، مما أدى إلى عزل الخبايا بأكملها، ورقة الظهارية، أو خلايا واحدة، تعتمد على الظروف التجريبية 4،5. هذه هي أساليب عالية الغلة، ولكن تم الإبلاغ عن التغييرات في إشارة بين الخلايا في ظل هذه الظروف التي قد لا تمثل البيئة المحلية 6،7. القبض على الليزر تسليخ مجهري يسمح لجمع المواد المكانية متميزة، ولكن يحقق الجزيئي المنخفض 8،9 الغلة. في أنسجة القولون الإنسان، مسلسل الطرق cryosectioning الأفقية وقد وضعت 10. ومع ذلك، والأنسجة المخاطية الفئران صغيرة باهظة للاعتماد المباشر لهذه التقنية. في البشر، وأطوال سرداب الأمعاء (والبعيدة بين سرداب قاعدة والخلايا السطحية) في القولون تتفاوت بين ~ 100-1،000 ميكرون 11. في الفئران، وأطوال سرداب ما بين 50-300 ميكرون ~ (انظر الشكل 1A). صغر حجم الخبايا الفئران تحديا لايزولانشوئها من هؤلاء السكان اثنين من خلية باستخدام بروتوكولات القائمة. نحن الآن وصف منخفضة التكلفة، وطريقة العائد المرتفع لعزل سرداب قاعدة وسطح السكان الخلايا الظهارية في أنسجة القولون الفئران. الأنسجة التي تحصد في هذه الطريقة قد ثم يتم تحليلها من قبل عدد من التطبيقات المصب القياسية، بما في ذلك تلطيخ المناعي، RT-PCR (في الوقت الحقيقي، البلمرة المتسلسل) أو النشاف الغربي.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Germany</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ كاشف PCR في الوقت الحقيقي</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 & nbsp;</td><td>مجهر كارل زايس</td><td></td><td>متحد البؤر</td></tr><tr><td></td><td>OCT Tissue-Tek ، ساكورا فينيتيك ، تورانس CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>العفن المبرد</td><td>Tissue-Tek ، ساكورا فينيتيك ، تورانس CA</td><td>4557</td><td>25 مم × 20 مم × 5 مم</td></tr><tr><td>شفرة ميكروتوم رفيعة المستوى</td><td>Leica Biosystems ، Nussloch ألمانيا</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>شفرات GEM الصناعية شفرات</td><td>الحلاقة الأمريكية للسلامة</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة سيلجارد من المطاط الصناعي من السيليكون</td><td>داو كورنينج ، ميدلاند ميشيغان</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 جم إبرة</td><td>بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي</td><td></td><td>دبابيس 305109 للتشريح</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة KLF4</td><td>إشارات الخلية</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة الثانوية Alexa المترافقة</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 الأجسام المضادة للأرانب</td></tr><tr><td>الثانوية HRP مترافقة</td><td>جاكسون</td><td>111 / 115-001-003</td><td>أرنب / فأر &nbsp ؛</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs عازلة الملح المتوازنة</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA تحلل المخزن</td><td></td><td></td> المؤقت <td>50 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.4 150 ملي كلوريد الصوديوم 1٪ NP40 0.25٪ Na-deoxycholate</td></tr><tr><td>التمهيدي TBP</td> <td>3'GGATTGTACCGCAGCTTCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>التمهيدي TBP</td> <td>5'GATGACTGCACAAATCGCTT</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>التمهيدي KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>التمهيدي KLF4</td> <td>5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الطريقة cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

يوفر النسيج المخاطي للقولون حاجزا حيويا للمستضدات اللمعية. يتكون هذا الحاجز من طبقة أحادية من الخلايا الظهارية العمودية البسيطة. يتم قلب ظهارة القولون ديناميكيا وتتولد الخلايا الظهارية في الخلايا الجذعية التي تحتوي على خبايا ليبركون. تهاجر الخلايا السلفية المنتجة في قواعد القبو نحو السطح اللمعي ، وتخضع لعملية التمايز الخلوي قبل أن يتم إلقاؤها في تجويف الأمعاء. من أجل دراسة هذه العمليات على المستوى الجزيئي ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة للتشريح الدقيق لمنطقتين متميزتين مكانيا من الغشاء المخاطي للقولون. منطقة القبو التكاثرية ، والخلايا الظهارية السطحية المتمايزة. هدفنا هو عزل مجموعات محددة من الخلايا الظهارية والسطحية من الغشاء المخاطي للقولون الفأر لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين.

تم تجهيز أقسام الأنسجة القولون لتقييم النسيجي وH &amp; E تلطيخ 13. وينظر الى عرض المقطع العرضي التقليدي للالغشاء المخاطي في الشكل 2A. المناطق القاعدية تحتوي على الط العضلية، وتتكون أساسا من العضلية الدائرية. وانطلاقا نحو التجويف، والعضلية المخاطية واضح المتاخمة للخلايا الظهارية-سرداب قاعدة والخلايا الانتقالية هي في منتصف الأنسجة، وأخيرا، يواجه سكان الخلية سطح التجويف الأمعاء. طريقة باجتزاء المسلسل هو موضح هنا يؤكد هذا التوجه بحيث العضلية الطولية والدائرية واجهت أول (الشكل 2B)، تليها العضلية المخاطية (الشكل 2C). لاحظ ظهور خلايا الخلالية غير العضلات في الجزء العلوي الأيسر من الصورة. لوصف تحليل المصب أدناه، يتم تجاهل أقسام العضلات. الأقسام اللاحقة تحتوي على الخلايا الظهارية والنسيج الخلالي (الصفيحة المخصوصة)، بدءا من خلايا سرداب قاعدة (الشكل 2D). لاحظ عدم وجود التجويف المركزي في معظم الخبايا، التي يبدو أغمق بسبب نوى معبأة بشكل وثيق. هذه الطبقات تحتوي على مقصورة التكاثري. الخلايا الانتقالية تظهر معبأة بإحكام الغدد مع شمعة وسط بارزة (الشكل 2E). وأخيرا، السكان خلية السطح لديها بنية غير منتظمة، مع مناطق أحادي الطبقة الظهارية ينظر أون الوجه (الشكل 2F). ويمكن أيضا معالجة مسلسل أقسام على النحو المبين أعلاه لوضع العلامات المناعي والفحص المجهري متحد البؤر (كما هو موضح هنا 14). الشكل 2G معارض الخبايا معزولة الثابتة وpermeabilized في الميثانول بنسبة 100٪ وبعد ذلك الملون للنوى (الأزرق) والبروتين تقاطع خلية خلية نطيقة النطيقة 1 (ZO-1، الأخضر). في الاتجاه باجتزاء التقليدية، ويمكن أن ينظر خلية سرداب والسطحية في وقت واحد (الشكل 2G </stronز&gt;). لاحظ أن ZO-1 خطوط موصلي وصمة عار لمعة من سرداب القولون. ويمكن أيضا أن ينظر إلى هذه البطانة Z0-1 من التجويف في عينات مقطوع المسلسل من السكان الخلايا الانتقالية، في مركز الغدد دائرية الشكل (2G). ويعتبر تعزيز ZO-1 وصمة عار في السكان الخلية السطحية (الشكل 2I وJ). ومن المعروف أن عدة عوامل التمايز أن يتم التعبير عنها بطريقة الزمانية المكانية على طول محور سرداب إلى السطح. ويشمل هذا العامل عامل النسخ Kruppel الشبيهة 4 (KLF4)، والذي يعرف لتخصيبه في السكان الخلية السطح. باستخدام أساليب باجتزاء التقليدية، وجدت KLF4 في نوى التجويف التي تواجه سكان الخلية السطحية (الشكل 2K). وبالتالي فإننا تكهن بأن KLF4 مرنا سيتم التعبير عنه في الغالب في السكان الخلية السطح. لاختبار هذا، وقد تم جمع الأجزاء المتسلسلة وتجميعها في العينات السطحية، الانتقالية، وسرداب قاعدة. Subsequently، كان حصادها RNA باستخدام استخراج Trizol القياسية، مع تنقية إضافية عن طريق العمود RNeasy والعلاج الدناز. وقد تم جمع الحمض النووي الريبي من 5 أقسام متتالية المجمعة، والتي أسفرت عن بين 5-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لكل عينة. ثم تم إخضاع هذه العينات لنصف الكمية في الوقت الحقيقي PCR لكلا KLF4 والجين المرجعية، TATA مربع بروتين ملزمة 1 (TBP-1) (الشكل 2L) 14. كما هو مبين في الشكل 2L، بعد تطبيع لTBP-1، تم العثور على الخلايا السطحية للتعبير عن ما يصل إلى 8 أضعاف KLF4 مرنا التي يعبر عنها في خلايا سرداب. وبالمثل، تم العثور على مستويات البروتين KLF4 لعرض التنظيم المكاني على طول محور سرداب أرض. وكان يتم تجميع الأجزاء المتسلسلة كما هو موضح أعلاه ثم حضنت في تحلل العازلة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. ونتجت عن ذلك بين 200-250 ميكروغرام من البروتين لكل عينة. عينات ثم تعرض تحليلها من قبل SDS-PAGE (الشكل 2M) 15. كما هو مبين في الشكل 2M، KLF4 صمستويات rotein هي أعلى بشكل كبير في أعداد الخلايا السطحية. النتائج المذكورة أعلاه تدل على قدرة هذا البروتوكول لعزل كميات كبيرة من المياه السطحية والخلايا الظهارية سرداب من الغشاء المخاطي للقولون الفئران. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> الشكل 1: (A) عرض تخطيطي الغشاء المخاطي للقولون الفئران وطبقات العضلات الخارجية. ويهدف لدينا وسيلة لجمع الخلايا السطحية وسرداب قاعدة السكان خلية منفصلة من قبل cryosectioning التسلسلي (10 ميكرون لكل منهما). يتم تجاهل طبقات العضلات الخارجية. (B) القبو ارتفاع يتفاوت على طول القولون (المسافة بين سرداب قاعدة وسطح طبقات). نقاط البيانات تشير القياسات سرداب الفردية والرموز تشير مكررات البيولوجية (ن = 4). (C) شرائح القولون التي تم جمعها، أوصال، ويشبك على طبق السيليكون تشريح. (D) والأنسجة ذاتهاgment الضغط حوالي 3 سم من فتحة الشرج بين لشفرات الحلاقة والمجمدة على الثلج الجاف. (E) الأنسجة ثم يتم تركيبه على التعادل قبل كتلة أكتوبر. تتم إزالة (F) Cryosections وتفقد البصر. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> الشكل 2: بيانات تمثيلية (A) أنسجة القولون ملطخة الهيماتوكسيلين-يوزين في المقطع العرضي تبين العضلية الدائرية (سم)، والعضلية المخاطية (مم)، وخلايا سرداب قاعدة والخلايا الانتقالية، والخلايا السطحية. (B - C) طبقات العضلات القولون. (D) خلايا القبو قاعدة. لاحظ عدم وجود التجويف المركزي. (E) الخلايا الانتقالية. (F) الخلايا السطحية. (G) المناعي تلطيخ من الخبايا القولون المعزولة. ويلاحظ ZO-1 (الخضراء) ونوى (الأزرق) في المقطع العرضي. (مرحبا) ZO-1 وتلطيخ النووي في الخلايا الانتقالية والسطحية. (J) صورة مكبرة من ZO-1 تلطيخ. (K) KLF4 (الأخضر) غير المخصب في السكان الخلية السطح. (L) في الوقت الحقيقي PCR تقييم مستويات KLF4 مرنا بين المقصورات الثلاث. (M) تحليل لطخة غربية من مستويات البروتين KLF4 في هؤلاء السكان الخلية.

هنا نصف طريقة بسيطة لعزل الخلايا السطحية الظهارية للقولون الفئران المتميزة مكانيا عن خلايا قاعدة السربات الأساسية.

الطريقة Cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو التشريح المجهري لمنطقتين متمايزتين مكانياً في القولون، وهما منطقة خبايا K التكاثرية، والخلايا الظهارية السطحية المتمايزة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة قولون الفأر، ثم تجميد النسيج بين لوحين معدنيين في الخطوة الثانية.بعد ذلك، يتم تثبيت النسيج على قالب OCT مستوٍ مسبقاً. وتتمثل الخطوة النهائية في تقطيع النسيج باستخدام المقطع الجليدي (cryostat) بفواصل تبلغ 10 micron. وفي النهاية، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) أو لطخة ويسترن (Western blot) لإظهار التغيرات في تعبير الجينات والبروتينات.تكمن ميزة تقنيتنا في كونها سريعة، وغير مكلفة، وذات إنتاجية عالية. وقد قام بتنفيذ إجراءاتنا كريستيان غارنر شميدت، وهو فني في مجموعتنا. تمت مراجعة جميع الإجراءات التي استُخدمت فيها الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة إيموري، وأُجريت وفقاً لمعايير المعاهد الوطنية للصحة.بعد إعداد المبرد المقطعي (cryostat)، وكالمعتاد، قم بموازنة شفرات المبرد والمقابض عند درجة حرارة -20 °C. ثم املأ قالب تجميد فارغ بمركب درجة حرارة القطع المثالية (OCT) وقم بموازنته عند درجة حرارة -20 °C. ستستغرق هذه العملية 30 دقيقة تقريبًا.قم بإزالة مركب OCT المجمد من القالب وتثبيته على حامل العينات باستخدام سائل OCT. ضع الحامل في ذراع الميكروتوم واترك مركب OCT يتماسك لمدة 10 دقائق. اضبط الميكروتوم على سمك 10 ميكرون لكل مقطع، ثم قم بقشط كتلة OCT حتى تصبح مسطحة، وبعد ذلك أبعد ذراع الميكروتوم عن الشفرة بعدة سنتيمترات.بعد ذلك، قم بتجهيز شفرتين لكل عينة باستخدام مبرد معدني لثلم الحافة الحادة للشفرات. ثم قم بإزالة الحافة الألومنيوم باستخدام ملقط. جهز طبق زراعة أنسجة بقطر 10 سنتيمتر، مملوء بنسبة 50% بالسيليكون، ومع 10 إلى 15 دبوس تشريح.أضف خمسة ملليلترات من محلول hanks buffer بدرجة حرارة الغرفة إلى الطبق بعد القتل الرحيم للفأر وفقًا للطرق المعتمدة واستئصال قطعة من القولون القاصي تقع على مسافة تتراوح بين 0 و 6 سم من الشرج. استخدم المقص للقطع. افتح القولون طوليًا وأزل المحتويات البرازية.قم بتثبيت النسيج في طبق التشريح السيليكوني الذي يحتوي على محلول Hank's buffer بحيث يكون السطح المخاطي متجهاً للأعلى. قم بشد النسيج باستخدام دبابيس التشريح، ثم اتركه ليرتاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الثنيات من النسيج والسماح لطبقات العضلات بالاسترخاء.بعد استراحة النسيج، قم بإزالة جميع الدبابيس باستثناء الدبابيس الطرفية. مرر شفرة حلاقة أسفل المقطع المطلوب من النسيج، ثم قم بتصريف محلول hanks buffer. أضف شفرة حلاقة أخرى من الأعلى لعمل ما يشبه الشطيرة.اقطع قطعة النسيج وأزل دبابيس التثبيت الطرفية. انقل شطيرة النسيج المثبتة بشفرة الحلاقة إلى الثلج الجاف. اترك النسيج يتجمد لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق.ارفع شريحة النسيج المحصورة بين شفرتي الحلاقة واتركها تدفأ قليلاً بوضع إصبعك على الشفرة العلوية. افصل الشفرتين ثم قم بالقص حول حواف قطعة النسيج، بحيث يتم قطع قطعة نسيج تبلغ أبعادها 0.5 centimeters تقريباً في 1 centimeter.اترك النسيج ليدفأ حتى يبدأ الجليد الموجود فوقه في الذوبان. عند هذه النقطة، اضغط النسيج بسرعة وعناية داخل قالب OCT. وفي جهاز المقطاع بالتبريد (cryostat)، ضع إصبعك فوق العينة.سيتيح لك انتقال الحرارة إزالة الشفرة دون إتلاف النسيج. قم بتغطية النسيج بمركب OCT واتركه ليتوازن لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بقطع مقاطع بسمك 10 microns.ضع المقاطع على شريحة وافحصها بصرياً حتى تظهر الخبايا. ضع المقاطع في أنابيب سعة 1.5 milliliter أو على شرائح. تُظهر هذه الصورة نسيجاً قولونياً مصبوغاً بـ hematin eoin في مقطع عرضي تقليدي، حيث تم تحديد العضلات الدائرية بالرمز cm.تظهر بوضوح طبقة العضلات المخاطية التي تحمل الرمز MM، وخلايا قاعدة الخبيئة، والخلايا الانتقالية، والخلايا السطحية. تُظهر هذه الصورة العضلات الدائرية بعد إجراء قطاعات متسلسلة. ومع التقدم نحو الخلايا السطحية، تظهر طبقة العضلات المخاطية.تظهر هذه الصورة خلايا قاعدة الخبايا المصبوغة بـ h و D بتكبير أعلى. لاحظ غياب اللمعة المركزية. تظهر هنا الخلايا الانتقالية، وتوضح هذه الصورة الخلايا السطحية.تظهر الصور التالية صبغاً مناعياً فلورياً لخبايا قولونية معزولة، حيث تم الصبغ لبروتين الوصلات بين الخلايا. يظهر بروتين Zonula occludens-1 أو ZO-1 باللون الأخضر، بينما تظهر النوى باللون الأزرق في المقطع العرضي. وتظهر هنا الخلايا الانتقالية والسطحية بعد إجراء تقطيع متسلسل.يتم التعبير عن العديد من عوامل التمايز بطريقة زمانية ومكانية على طول محور سطح الخبيئة. ويشمل ذلك عامل النسخ cripple like factor four الموضح باللون الأخضر، والذي يتركز في مجموعات الخلايا السطحية عند العرض في مقطع عرضي؛ حيث يتيح التقطيع المتسلسل إجراء تقييم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) لمستويات mRNA لـ KLF four بين الحجرات الثلاث. وأخيراً، يوضح تحليل لطخة ويسترن (western blot) مستويات بروتين KLA four في مجموعات الخلايا هذه.لا تنسَ أن التعامل مع شفرات الميكروتوم يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا كن حذراً جداً عند تنفيذ هذا الإجراء.

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية لعزل الخبايا الكاملة من الأمعاء الدقيقة للفأر. يمكن استخدام الخبايا الكاملة المعزولة لنشر العضيات ثلاثية الأبعاد طويلة العمر وذاتية التجديد في المختبر.

عزل الخبايا المعوية: طريقة لعزل الخبايا الكاملة عن الأمعاء الدقيقة لنموذج الفئران

هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وcryosections PP لالمناعية.

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

والأرومة الليفية العضلية هي الخلية اللحمية تأثيرا في الجهاز الهضمي الذي ينظم العمليات الفسيولوجية الهامة في الدول العادية والمرض. نحن تصف تقنية تسمح لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان، والتي يمكن استخدامها في المختبر لالتجريب.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

يتم وصف استخدام جهاز بسيط لقطع و "دحرجة" أمعاء الفئران لتحضير مستحضرات التثبيت الكاملة بسرعة.

جهاز بسيط للتحضير السريع الجبال الجامعة للماوس الأمعاء

يتم جمع متتالية المقاطع البرد لتمكين التطبيقات النسيجية والإثراء من الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. يتم الحصول على جودة عالية RNA 20-30 ملغ من cryosections والقياسات المجمعة تتم مقارنة مباشرة عبر تطبيقات.

Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية المعزولة من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). ويشمل هذا البروتوكول إعداد فلاش تجميد عينات من الأنسجة المعوية البشرية، كريوسيكتيونينج، وتلطيخ ethanolic والجفاف، LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي.

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

خلايا Enterochromaffin (EC) تضم مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا الظهارية المعدية المعوية. خلايا الجماعة الأوروبية منفعل كهربائياً وإطلاق السيروتونين، بعد صعوبات في استزراع وتحديد خلايا الجماعة الأوروبية محدودة الدراسات الفسيولوجية. الطريقة المعروضة هنا تؤسس نموذج ثقافة الأولية قابلة للفحص لخلايا الجماعة الأوروبية الكهربية.

الكهربية كل خلية من خلايا Enterochromaffin موريني مثقف الأولية

الافتقار إلى التوحيد القياسي لتجهيز الأنسجة موريني يقلل نوعية التحليل نسيجية موريني مقارنة بالعينات البشرية. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ دراسة نسيجية مورين الأنسجة colonic ملتهبة وأونينفلاميد لإظهار جدوى نظم الروبوتية المستخدمة بصورة روتينية لتجهيز وتضمينها العينات البشرية.

استخدام النظم الآلية للعملية وتضمين Colonic موريني عينات لإجراء تحاليل نسيجية

الهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا أحادية النووية التي توجد في بروبريا لامينا القولون عن طريق الهضم الأنزيمي للأنسجة باستخدام الكولاجين. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا أحادية النووية بكفاءة مما يؤدي إلى تعليق خلية واحدة والتي بدورها يمكن استخدامها للنماذج المناعية القوية.

عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

هنا، نقدم وصفا مفصلا للإجراءات التي تحث خزعات قرصة متناظرة موجهة في الفئران وتتبع إغلاق الجروح في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير طرق لإعداد الأنسجة للتحليلات النسيجية والمناعة الكيميائية والجزيئية لسرّد الجرح.

إجراء خزعات قرصة مُرشدة بالمنظار في الفئران وتقييم التغيرات اللاحقة في الأنسجة

يصف البروتوكول الحالي إنشاء نظام عضوي قولوني للفئران لدراسة نشاط وعمل الخلايا الجذعية القولونية في نموذج خروج المغلوب claudin-7.

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

تعلم تقنية التقطيع المجهري للأنسجة المجمدة لعزل خلايا الظهارة القولونية في الفئران. تتيح هذه الطريقة السريعة والاقتصادية دراسة التعبير الجيني والبروتيني بدقة عالية.

الطريقة Cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي

استكشف المزيد من الفيديوهات