تحليل يرسينيا القولون المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس انتقال البروتين المستجيب إلى الخلايا المضيفة عبر نظام إفراز vernia من النوع الثالث. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان خلايا الكعب مع طفرات يرسينيا التي تعبر عن اندماجات المستجيب TEM واحد بيتا لاكتاماز للسماح بنقل اندماجات المستجيبات إلى خلايا HELOC. كخطوة ثانية ، يتم تحميل خلايا HELOC المصابة بمركب مراسل حنق دائم للخلية ، والذي تتم معالجته بواسطة الإسترو الخلوي إلى المشحونة في CCF الفلوري الرابع وبالتالي محاصرة داخل الخلية.

الانقسام التالي ل CCF four بواسطة بيتا لاكتاماز الموجود عبر إلى تعطيل fre ، والذي يتم تسجيله عن طريق الفحص المجهري بالليزر من أجل تحليل شدة التألق المتبرع والمقبل. تظهر النتائج كميات مختلفة من المستجيب المتحولة TEM واحد اندماج بيتا لاكتاماز بناء على حركية مختلفة لارتفاع مضان المتبرع. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية في أن المعالجة بين الخلايا لمركب CCF الرباعي توفر أداة محددة وحساسة للغاية لقياس الإزاحة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التسبب في البكتيريا ، مثل كيفية ضبط النقل بدقة أثناء تفاعل البكتيريا والخلايا المضيفة قبل يوم واحد من الإصابة. تلقيح ثلاث قوارير منفصلة تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط LB والمضادات الحيوية المطلوبة بمستعمرة واحدة من كل سلالة من السلالات المحولة من Y enterocolitica المحضرة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. قم أيضا بإعداد أطباق تحتوي على خلايا الكعب في اليوم السابق للإصابة عن طريق زرع 15،000 خلية في 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع في تسعة آبار من صفيحة 96 بئر تحتضن الخلايا في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية في يوم الإصابة.

قم بتلقيح ملليلترين من المزرعة الليلية في 40 مل من متوسط رطل طازج بدون مضادات حيوية. احتضان البكتيريا لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر بسرعة 180 دورة في الدقيقة. سيؤدي ذلك إلى التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث بعد 90 دقيقة ، ونقل الثقافات إلى أنبوب جديد والحفاظ على الثقافات على الجليد.

من هذه النقطة فصاعدا. الطرد المركزي الثقافات لمدة 10 دقائق عند 5 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لحبيبات البكتيريا. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من PBS البارد المثلج ، وقم بتخفيف تعليق البكتيريا إلى تركيز 800 مليون وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر ، ثم ضع الثقافات على الجليد.

ثم حدد الكثافة البصرية المقابلة لكل ثقافة. أضف 3.5 ميكرولتر من المعلق البكتيري من كل سلالة إلى آبار مختلفة من 96 المحضرة. صفيحة جيدة وتخلط عن طريق سحب الوسط برفق مرتين ، مما يسمح للبكتيريا بالترسيب على الخلايا بدافع إصابة حوالي 100 بكتيريا لكل خلية.

قم بإجراء دورة زمنية عن طريق بدء العدوى على فترات 30 دقيقة وإبقاء الخلايا في غرفة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. بعد كل إصابة ، بعد 90 دقيقة من الإصابة الأولى ، قم بشفط الوسط بعناية دون إزالة أي من خلايا هيلا. ثم أضف 50 ميكرولترا من PBS تحتوي على 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الكلورامفينيكول ، و 2.5 ملليمولار برونيك.

سيؤدي ذلك إلى إيقاف التعبير عن المؤثرات وتقليل تصدير CCF الأربعة. لتحضير الفحص المجهري ، تأكد من الغمر المستمر عن طريق نشر وسط الغمر في قاع الآبار ، باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد. تجنب حبس أي فقاعات هواء في وسط الغمر.

ثم انقل لوحة البئر 96 إلى مرحلة المجهر وحدد الأماكن المناسبة للتحليل اللاحق في كل منها. حسنا ، قم بإنهاء هذه الخطوة في غضون 10 دقائق. ثم أضف 70 ميكرولترا من محلول التحميل CF 4:00 صباحا إلى كل منها.

احتضن الطبق جيدا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول التحميل وأضف 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الكلورامفينيكول ، و 2.5 ملليموضحس. ثم ابدأ الفحص المجهري بسرعة.

ضع هدف غمر بفتحة عدمية عالية التكبير 20 ضعفا في مكانه وافتح ثقب الكاشف إلى 2.5 وحدة جيدة التهوية وانقل لوحة البئر 96 إلى مرحلة المسح بالليزر متحد البؤر. بعد ذلك ، اختر كاشفات فوسفات زرنيخيد الغاليوم عالية الحساسية مع قنوات مانحة ومتقبلة نشطة في وقت واحد. إطار ثلاثي الأبعاد بعمق ثمانية بتات متوسط وإثارة مع 10٪ من ليزر الصمام الثنائي 405 نانومتر.

لضمان القياس الكمي الصحيح ، اضبط كسب الكاشف لكلتا القناتين على نفس القيمة وتجنب أي وحدات بكسل مشبعة. بعد ذلك ، قم بتنشيط الضوء المرسل وأعد التحقق من مجالات الرؤية التمثيلية في كل شيء ، وقم بضبط المواضع جيدا وإعادة حفظها حسب الحاجة باستخدام مرحلة تلقائية معايرة. أخيرا ، اضبط الفاصل الزمني على دقيقتين ، والمدة على ساعتين ، وابدأ في الحصول على الصور.

بعد الحصول على الصور ، قم باستيراد مجموعة البيانات إلى برنامج يسمح بالعمليات الحسابية لمصفوفات البكسل. اطرح الخلفية في كلتا القناتين باستخدام نفس الإزاحة بالنقر أولا على القائمة ، ثم انتقل إلى معالجة الصور وحدد طرح خط الأساس. ثم حدد كل قناة وأدخل قيمة الأساس.

قم بتصحيح النزيف من خلال القناة المانحة ، وقم بتوجيه واحد إلى قناة المستقبل الثانية باستخدام عامل التصحيح المحدد مسبقا ، مما يؤدي إلى إنشاء قناة قناة جديدة اثنين أولية لهذه الغاية. انقر فوق القائمة ثم حدد معالجة الصور متبوعة بحساب القناة وأدخل القيمة المطلقة للقناة الثانية مطروحة بالنقطة 33 مرة. القناة الأولى بعد ذلك، احذف القناة الثانية وتأكد من بقاء الهوامش من خلال قناة القبول المصححة كقناة جديدة اثنتين.

ثم قم بإنشاء قناة جديدة مع العملية الموضحة هنا لتحديد معامل الحنق النسبي. بعد ذلك ، ارجع إلى قائمة حسابات القناة وأدخل القناة الثانية مقسومة على القناة واحدة بالإضافة إلى القناة الثانية للتصور الصحيح لقناة الحنق. في صورة ثمانية بتات ، قم بإنشاء قناة رابعة قناة أربعة ، وهو ما يساوي 255 في القناة ثلاثة.

قم بتغيير لون القناة بالانتقال إلى قائمة خصائص الصورة ، وحدد القناة أربعة ، ثم اللون المعين ، متبوعا بملف جدول الألوان ، وحدد jet. بعد ذلك ، قم بتطبيق مرشح متوسط ثلاثة في ثلاثة على القناتين الثالثة والرابعة. سيؤدي ذلك إلى تقليل الضوضاء في الصور عن طريق الدخول إلى قائمة معالجة الصور وتحديد التنعيم.

متبوعا بمرشح متوسط ، حدد كلتا القناتين وقم بتطبيق حجم مرشح ثلاثة في ثلاثة في واحد لتقدير الإشارات الخلوية. اكتشف الخلايا في القناة الرابعة عن طريق تحديد تجاوز العرض والنقر على الرمز. أضف أسطحا جديدة.

حدد معلمات خوارزمية الكشف في نافذة السطح وقم بتنشيط خانتي الاختيار. قم بتقسيم منطقة الاهتمام فقط وقم بمعالجة الصورة بأكملها. أخيرا ، بعد ذلك ، حدد منطقة الاهتمام عن طريق تحرير أبعادها.

حدد القناة الرابعة كقناة المصدر وقم بتعيين الحد بالانتقال إلى قائمة العتبة وتحديد طرح الخلفية. اضبط القطر على 10 ميكرومترات ، والحد الأدنى للشدة يدويا على الصفر والحد الأقصى للكثافة القصوى. قم بتصفية الهياكل حسب المساحة واضبط الحد الأدنى للقيمة على 187 ميكرومتر مربع.

ثم قم بإنهاء الكشف عن السطح. أخيرا ، استخرج القيم المتوسطة لشدة مضان المتبرع في القناة الأولى ومعامل الحنق النسبي في القناة الثالثة ، جنبا إلى جنب مع انحرافات معيارية في الكيان الخلوي. لإظهار قدرة هذه الطريقة على التحليل الكمي لانتقال المستجيب إلى الخلايا المستهدفة ، تمت دراسة سلالتين من اليرسينيا مع حركية نقل مختلفة باستخدام كل من مضان المتبرع ومعاملات الحنق النسبي.

تظهر الخلايا المصابة من النوع البري زيادة في شدة التألق بمرور الوقت. كما هو متوقع ، يرتبط الميل الأقصى لشدة التألق ارتباطا إيجابيا بطول العدوى ، مما يشير إلى أنه يمكن تمييز تركيزات مختلفة من بيتا لاكتاماز المترجم وفقا للدراسات السابقة. تظهر الخلايا المصابة بطافرة حذف yersinia YOPE زيادة أسرع في شدة التألق مقارنة بسلالة النوع البري.

ومن المثير للاهتمام أن توسيع العدوى إلى 90 دقيقة لم يسرع من ارتفاع مضان المتبرع مقارنة ب 60 دقيقة من العدوى أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن معالجة مركب CCR الرابع تبدأ فور إضافته. لذلك ، من المهم البدء في الحصول على الصور في الوقت المناسب.