تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس إفراز البروتين من الخلايا الفردية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية. يتم تحقيق ذلك من خلال تصنيع أجهزة الاستشعار النانوية البلازمونية الذهبية بالطباعة الحجرية على زلات الغطاء الزجاجي للتصوير الخالي من الملصقات لإفرازات الخلية الواحدة. كخطوة ثانية ، يتم تنظيف شريحة المستشعر وتغليفها بطبقة أحادية التجميع ذاتيا ثم يتم تشغيلها باستخدام روابط لها تقارب كبير مع بروتينات التحليل المفرزة.

يتم دمج الخلايا التالية في رقائق المستشعر الوظيفية من أجل قياس إفرازاتها في المكان والزمان. تظهر النتائج أنه يمكن تعيين إفرازات البروتين من الخلايا الفردية مكانيا وزمانيا دون الحاجة إلى وضع العلامات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاتصال بين الخلايا ، مثل كيفية تحكم مسارات إشارات paracrine و autocrine في حركة الخلية.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإيداع طبقة رقيقة من الكروم 10 نانومتر على زلات الغطاء التي تم تنظيفها مسبقا عن طريق تبخر شعاع الإلكترون لتجنب تأثيرات الشحنة أثناء الزخرفة وتصوير الهياكل النانوية. بعد هذا الدوران ، تقاوم الطبقة الأولى من الطبقة الثنائية التي تتكون من إيثيل لاكتات ، ميثيل ميثاكريليت كوبوليمر عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. ثم اخبز الركيزة على حرارة 150 درجة مئوية بعد السماح للركيزة بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بتدوير الطبقة الثانية من بولي ميثيل ميثاكريلات عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية واخبز الركيزة عند 150 درجة مئوية. تقاوم الطبقة الثنائية باستخدام الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون أو EBL. قم بتطوير كحول الأيزوبروبيل أو IPA ميثيل إيزوبوتيل كيتون ، أو MIBK بنسبة اثنين إلى واحد وشطفها في IPA.

قم بإزالة الكروم من المنطقة المطورة للهياكل النانوية عن طريق الحفر الرطب باستخدام حفر CR سبعة لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة ثم اشطفها بالماء المقطر منزوع الأيونات وقم بإيداع طبقة ذهبية من التيتانيوم على الركيزة باستخدام مبخر شعاع الإلكترون بعد ترسيب الذهب. ارفع طبقة ثنائية البوليمر. قاوم عن طريق نقع الركيزة في الأسيتون لمدة أربع ساعات.

بعد ذلك ، افحص الركيزة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح لتأكيد شكل وحجم البنية النانوية. عادة ما يتم فصل الهياكل النانوية الناتجة بدرجة 300 نانومتر. 20 × 20 مصفوفات من الهياكل النانوية متباعدة بمقدار 30 ميكرون من المركز إلى المركز.

ترك مساحة واسعة لتصوير الخلايا ، ستحتوي الشريحة النموذجية على 300 مصفوف. قم بإزالة الكروم المتبقي من الركيزة عبر الحافة الرطبة باستخدام حفر CR سبعة لمدة 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف الركيزة في الماء المقطر منزوع الأيونات.

ثم افحص مجموعة فرعية من المصفوفات باستخدام مجهر القوة الذرية للتحقق من الحجم والتوحيد. يمكن استخدام زلة الغطاء الزجاجي المزخرفة هذه عدة مرات طالما تم اتباع إجراءات التنظيف المناسبة لتنظيف وتجديد البلازما السطحية الموضعية ورقائق الرنين أو LSPR. رماد البلازما بقوة 40 واط في 300 ملي إلى خليط من 5٪ هيدروجين و 95٪ أرجون لمدة 45 ثانية.

قم بتشغيل سطح الذهب والهياكل النانوية مباشرة بعد رماد البلازما. عن طريق غمر الرقاقة في محلول ثيول الإيثانول مكون من عنصرين يتكون من نسبة ثلاثة إلى واحد من SPO و SPC. بعد ترك الشريحة في محلول الثيول طوال الليل لتشكيل طبقة أحادية التجميع ذاتيا ، اشطفها بالإيثانول وجففها بغاز النيتروجين ، قم بتحميل شريحة LSPR داخل حامل موائع دقيقة مصنوع خصيصا عن طريق وضع الشريحة على قطعة سفلية من الألومنيوم.

ثم ضع الرقاقة بين هذه القطعة السفلية وحشية سيليكون وقطعة علوية بلاستيكية شفافة باستخدام أربعة براغي لتثبيت التجميع. لتطبيق الثيول النموذجي القائم على SPC ، قم بإسقاط 300 ميكرولتر من خليط واحد إلى واحد من 133 ملليمولار EDC و 33 ملليمولار NHS في الماء المقطر منزوع الأيونات لتنشيط مجموعات الكربوكسيل لمكون SPC thiol. بعد الانتظار لمدة 10 دقائق ، اشطف السطح يدويا باستخدام 10 مللي مولار PBS بعد اقتران مجموعة الكربوكسيل المنشط مع الترابط محل الاهتمام عن طريق طلاء إسقاط 300 ميكرولتر من محلول الترابط.

بعد الانتظار لمدة ساعة وشطف السطح برمز إسقاط PBS 10 مللي مولار ، 300 ميكرولتر من 0.1 إيثانول أمين مولار في PBS على الرقاقة لتقليل الارتباط غير المحدد. بعد الانتظار لمدة 10 دقائق ، اغسل الإيثانول أمين باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.005٪ بين 20 أو PBST 20. بعد ذلك ، ضع قطعة كوارتز فوق الرقاقة لتقليل التقلبات في البيانات المتعلقة بتغيير الغضروف المفصلي.

حافظ على الشريحة مبللة باستخدام المخزن المؤقت PBST 20 أثناء التركيب على المجهر. قم بتوصيل أنبوب الموائع الدقيقة بالتجميع ومخزن التدفق المؤقت حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة. ثم ضع مجموعة رقاقة LSPR بإحكام في حامل عينة المرحلة الساخنة.

الإعداد البصري لهذه الطريقة هنا. يتم تمرير الضوء من مصباح الهالوجين عبر مرشح تمرير بطول 593 نانومتر للتخلص من الأطوال الموجية ، والتي لا تساهم في استجابة النانو البلازمونية. ثم يتم استقطاب الضوء خطيا وتضيء العينة عبر هدف فتحة عددية 40 × 1.4 لإثارة الهياكل النانوية الذهبية البلازمونية.

يتم جمع الضوء المتناثر بواسطة الهدف ويمر عبر مستقطب متقاطع لتقليل إشارة الخلفية من الركيزة الزجاجية. يتم إدخال مقسم شعاع 50 50 في مسار الضوء الذي تم جمعه لتحليل طيفي وصور متزامن. بعد السماح للتجميع والمجهر بالتوازن لمدة ساعتين على الأقل ، قم بمحاذاة الشريحة باستخدام عصا التحكم بحيث تتم محاذاة المصفوفة المركزية مع الألياف البصرية للتحليل الطيفي.

بعد زراعة خلايا DOMA الهجينة وتكويرها عن طريق الطرد المركزي ، قم بحصادها ، ثم اختبر صلاحيتها قبل إدخالها على رقائق LSPR. بعد ذلك ، أدخل 50 ميكرولترا من محلول الخلية يدويا على رقائق LSPR باستخدام ماصة دقيقة. أخيرا ، اغسل الخلايا المتبقية في المحلول بوسائط جديدة خالية من المصل باستخدام نظام وفرة الموائع الدقيقة لتحضير رقائق LSPR للتصوير.

هنا تراكب لصورة تصوير LSPR ، والتي تسلط الضوء على المصفوفات المربعة وصورة مضيئة بالضوء المرسلة ، والتي تسلط الضوء على الخلية في أسفل اليسار. خلية ملطخة بقضيب صبغ الغشاء الفلوري Domine ، يظهر DHPE الإضعاف مثل الامتدادات. إذا تداخلت هذه الامتدادات مع المصفوفات ، فإنها ستعطي إيجابية خاطئة لبيانات قياس طيف إفراز البروتين قبل وبعد إدخال محلول مشبع من الأجسام المضادة المضادة ل cmic إلى المصفوفات الوظيفية cmic التي يتم عرضها هنا.

تستخدم هذه الطريقة لمعايرة المصفوفات. تساعد معايرة المصفوفات في تطبيع استجابة المستشعرات وتحديد الإشغال الجزئي بناء على ملف تعريف الوظائف الحيوية لكل تشغيل. يتم استخدام أداة SPR تجارية لتحديد ثابت التفكك وكذلك لدراسة مقاومة الارتباط غير المحدد باستخدام نفس البروتوكول كما هو موضح لشريحة LSPR.

يتم عرض القيم الطبيعية من صفيفتين هنا. كانت إحدى المصفوفات على بعد 10 ميكرومتر من الخلية بينما كان التحكم على بعد 130 ميكرومتر من الخلية. تشير الزيادة المفاجئة في الاستجابة الطبيعية للمصفوفة الأقرب إلى الخلية بالنسبة للاستجابة المسطحة لمصفوفة التحكم إلى انفجار موضعي من الأجسام المضادة المفرزة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس إفرازات البروتين من الخلايا الفردية ذات الدقة المكانية والزمانية العالية.