الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التأثير المضاد للفيروسات للمركبات المختبرة ضد خطوات محددة من الدخول الفيروسي المبكر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع الخلايا المضيفة للإصابة الفيروسية، ثم تتمثل الخطوة الثانية في إجراء الإصابة الفيروسية ومعالجات المركبات المختبرة في أوقات ودرجات حرارة مختلفة.

بعد ذلك، يتم غسل اللقاحات المعالجة بالعقار وتغطية الخلايا بالوسط الأساسي. وتتمثل الخطوة النهائية في تحضين الخلايا. وفي نهاية المطاف، يتم تحليل القدرة المعدية للفيروس لتحديد تأثير المركبات المختبرة على خطوات الدخول الفيروسي المبكرة للعدوى الفيروسية.

على سبيل المثال، يُستخدم مقياس اللمعان (luminometer) لتقييم نشاط لوسيفيريز (luciferase) في الخلايا الناتجة عن العدوى بفيروس مراسل. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح باتباع نهج قائم على الآلية في تحديد العوامل المضادة للفيروسات، لا سيما تلك التي تستهدف دخول الفيروس. للبدء، قم أولاً بتحضير المحاليل المخزنة من المركبات المختبرة، trilogy acid أو CHLA و PUNIC collagen أو PUG في DMSO، وقم بإذابة heparin كضابط موجب في ماء مقطر مزدوج معقم لتحضير الخلايا المضيفة لزراعة المقايسة.

تُحضن خلايا سرطان الكبد البشري HUH 7.5 طوال الليل في وسط DMAM طازج مكمل بـ FBS والمضادات الحيوية. تذكر اتباع إجراءات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية طوال التجربة لاختبار السُمية الخلوية للمركبات المختبرة. تُعامل الخلايا بتركيزات متزايدة من CHLA أو PUG من 0 إلى 500 micromolar مخففة في الوسط الأساسي، أو 1%DMSO كعينة ضابطة سلبية، ثم تُحضن الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة Celsius في حاضنة زراعة الخلايا.

قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا بـ 200 µL من PBS مرتين. بعد ذلك، أضف 100 µL من كاشف XT T، واحضنها عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات. ثم استخدم قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) لتحديد الامتصاصية عند 492 nm مع طول موجي مرجعي عند 690 nm.

احسب النسبة المئوية للحيوية باستخدام صيغة محددة من هذه القيم. حدد تركيزات السمية الخلوية بنسبة 50% لكل مركب. لبدء مقايسة تعطيل الفيروس.

قم بزراعة الصفيحة الأولى بمعدل 1×10⁴ خلية لكل بئر. في صفيحة ذات 96 بئراً، يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون طوال الليل للسماح لها بالالتصاق تمهيداً للإصابة. قم بتحضير جزيئات فيروس التهاب الكبد C (HCV) المسمى ببروتين لوسيفيريز المراسل Gaia وفقاً لما ورد في البروتوكول النصي.

في أنبوب معقم، امزج 100 µL من CHLA أو PUG بتركيز 100 µM مع 100 µL من فيروس التهاب الكبد C (HCV) بتركيز 10⁴ من الوحدات المكونة للبؤر (FFU) لتحضير مزيج ضابط موجب. امزج HCV مع الهيبارين بتركيز نهائي قدره 1000 µg/mL.

يُحضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. وبعد مرور ثلاث ساعات، يتم تخفيف خليط المركب الفيروسي بمقدار 50 ضعفاً باستخدام 9.8 مليلتر من الوسط الأساسي في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم تحضير خليط مركب فيروسي جديد، ويُخفف هذا الخليط فوراً في الوسط الأساسي لعينة تحضين الساعة صفر.

بعد إزالة وسط الحضن من الخلايا، أضف 100 µL من محلول العقار الفيروسي المخفف لكل بئر في ثلاث مكررات. يحتوي المحلول الآن على 10² FFU لكل بئر؛ تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C و5% CO2 لمدة ثلاث ساعات للسماح بالعدوى الفيروسية للخلايا. بعد الحضن، أزل المعلق الفيروسي من الآبار واغسل الخلايا برفق باستخدام 200 µL من PBS مرتين.

قم بتحضين الخلايا في 100 µL من الوسط الأساسي لمدة 72 ساعة للسماح بالتضاعف الفيروسي وإفراز مراسل اللوسيفيراز في السائل الطافي. بعد ذلك، اجمع السائل الطافي من المزارع والأنابيب الدقيقة وقم بطردها مركزياً عند 17,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. ولإزالة الحطام الخلوي، اخلط 20 µL من كل سائل طافٍ مع 50 µL من كاشف مقايسة gaussi luciferase، ثم قم بقياس التألق الناتج عن نشاط مراسل اللوسيفيراز باستخدام جهاز قياس التألق (luminometer).

وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة الخاصة بصفيحة مقايسة الالتصاق الفيروسي، يتم وضع 1×10⁴ من الخلايا في كل بئر في صفيحة ذات 96 بئراً، ثم تُحضن طوال الليل لضمان التصاق الخلايا. وفي صباح اليوم التالي، يتم تبريد صفيحة الـ 96 بئراً التي تحتوي على الطبقة الأحادية من الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة.

قم بتحضير المركبات المختبرة ومزيج الفيروس على الثلج. على سبيل المثال، محاليل H-C-V-C-H-L-A-H-C-V بنسبة 1% DMSO أو محاليل HCV Heparin كضابط موجب مع 10² FFU من الفيروس. بالنسبة لكل معالجة، قم بشفط الوسط من آبار المزرعة الخلوية برفق.

بعد ذلك، أضف فوراً 100 µL من خليط مركب اختبار الفيروس في آبار مكررة ثلاث مرات، مع الحرص على عدم رفع درجة الحرارة. قم بتحضين الصفيحة في ثلاجة محفوظة عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات. ستلتصق الجسيمات الفيروسية بسطح الخلية عند درجة حرارة 4 °C، ولكنها لن تُمتص إلى الداخل.

بعد ذلك، يتم سحب السوائل الطافية. تُغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 200 µL من محلول PBS البارد جداً، ثم يُضاف 100 µL من الوسط الأساسي إلى كل بئر، وتُحضن بعد ذلك عند 37 °C لمدة 72 ساعة.

أخيراً، ولتقدير كمية مراسل لوسيفيراز (luciferase reporter) المنطلق من الخلايا المصابة، اجمع الطافي (supernat) من كل بئر عينة وأجرِ مقايسة Gaussian Luciferase لتقييم الاندماج والدخول الفيروسي. قم بتبريد طبق استزراع الخلايا مسبقاً عند 4 °C لمدة ساعة واحدة.

بعد التحضين طوال الليل لالتصاق الخلايا، قم بإزالة الوسط الموجود من الآبار وأصِب الخلايا بـ 10² F-F-U-H-C-V على الثلج. حضّن الطبق عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخلايا بلطف مرتين باستخدام 200 µL من PBS بارد جداً لإزالة الفيروسات غير الملتصقة.

بعد ذلك، وعلى الثلج، تُعالج الخلايا بالمركبات المختبرة المذابة في الوسط الأساسي، أو بالوسط الأساسي مع 1%DMSO كعينة ضابطة، وتُحضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. يتيح ذلك تقييم تأثير المركبات المختبرة على دخول الفيروس، والذي يحدث عند 37 درجة مئوية. يُشفط الوسط وتُغسل الفيروسات غير الداخلة مرتين باستخدام 200 microliters من محلول سترات المنظم أو PBS.

أضف 100 µL من الوسط الأساسي في كل بئر، ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 72 ساعة أخرى. اجمع السائل الطافي وأجرِ مقايسة Gaussian Luciferase كما تم توضيحه سابقاً للكشف عن مراسل luciferase المنطلق. تظهر هنا تأثيرات المركبات المختبرة على HCV. وفي عملية التنشيط، تم تحضين الفيروس مع المركبات المختبرة لمدة صفر أو ثلاث ساعات قبل العدوى.

تم رسم نسبة تثبيط العدوى الفيروسية لكل معاملة. ولا يُظهر DMSO، الذي استُخدم كضابط سلبي، أي تثبيط. بينما يُظهر CHLA تثبيطاً عالياً عند التلامس، وذلك بعد فترة حضانة مدتها صفر ساعة، وكذلك بعد فترة حضانة أطول لمدة ثلاث ساعات.

نتائج إضافية باستخدام اختبار آخر. تظهر هنا مركبات PUG، وباعتماد هذا التصميم التجريبي العام، يتبين أن CHLA و PUG يثبطان أيضاً قدرة الفيروس المضخم للخلايا البشري أو HCMV على العدوى في الخلايا الليفية الرئوية الجنينية. ويظهر هنا تأثير CHLA و PUG على ارتباط فيروس HCV.

تذكر أنه تم تحضين الخلايا مع الفيروس في وجود أو غياب المركبات المختبرة عند درجة حرارة 4 °C، ثم بعد إزالة الفيروس غير المرتبط، تم تحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 °C لحدوث العدوى بالفيروس. توضح الأعمدة المظللة تأثير C-H-L-A-P-U-G أو الهيبارين على دخول HCV إلى الخلايا. لاحظ أنه في هذه الحالة، تم إجراء الارتباط الفيروسي أولاً عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، وعقب إزالة الفيروسات غير المرتبطة، تم تحضين الخلايا مع المركبات المختبرة عند 37 درجة مئوية للسماح بدخول الفيروس. وبالمثل، في حالة فيروس HCMV، يظهر علاج الخلايا الليفية الرئوية الجنينية بمركب CHLA أو PUG تثبيطاً قوياً لالتصاق الفيروس ودخوله. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تنفيذ الخطوات عند درجة الحرارة المحددة، حيث يؤثر ذلك على دقة النتائج.