الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التأثير المضاد للفيروسات لمركبات الاختبار مقابل خطوات محددة للدخول المبكر للفيروس. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع الخلايا المضيفة أولا للعدوى الفيروسية. الخطوة الثانية هي إجراء العدوى الفيروسية والعلاجات المركبة للاختبار في أوقات ودرجات حرارة مختلفة.

بعد ذلك ، يتم غسل اللقاحات المعالجة بالأدوية ويتم تغطية الخلايا بوسط قاعدي. الخطوة الأخيرة هي احتضان الخلايا. في النهاية ، يتم تحليل العدوى الفيروسية لتحديد تأثير مركبات الاختبار على خطوات الدخول الفيروسي المبكرة للعدوى الفيروسية.

على سبيل المثال ، يتم استخدام مقياس الإضاءة لتقييم نشاط لوسيفيراز في خلية اللعنة من العدوى بفيروس مراسل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تسمح بنهج أكثر اعتمادا على الآلية في تحديد العوامل المضادة للفيروسات ، لا سيما تلك التي تستهدف دخول الفيروس. للبدء ، أولا ، قم بإعداد محاليل مخزون من مركبات الاختبار ، حمض الثلاثي أو CHLA و PUNIC الكولاجين أو PUG في DMSO لإذابة الهيبارين للتحكم الإيجابي في الماء المقطر المزدوج المعقم لإعداد الخلايا المضيفة لثقافة الفحص.

سرطان الكبد البشري ، HUH 7.5 خلايا بين عشية وضحاها في DMAM الطازج المكمل ب FBS والمضادات الحيوية. تذكر اتباع إجراءات السلامة الحيوية من المستوى الثاني طوال التجربة لاختبار السمية الخلوية لمركبات الاختبار. عالج الخلايا بتركيزات متزايدة من CHLA أو PUG من صفر إلى 500 ميكرومولار مخفف في وسط قاعدي ، أو 1٪ DMSO كعنصر تحكم سلبي ، ثم احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا.

قم بإزالة الوسيط وغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من PBS مرتين. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف فحص XT T ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم استخدم قارئ الصفيحة الدقيقة لتحديد الامتصاص عند 492 نانومتر بطول موجي مرجعي عند 690 نانومتر.

احسب النسبة المئوية للجدوى باستخدام صيغة معينة من هذه القيم. تحديد تركيزات السمية الخلوية بنسبة 50٪ لكل مركب. لبدء فحص التعطيل الفيروسي.

اللوحة الأولى ، واحدة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. في صفيحة 96 بئر ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل للارتباط بالعدوى. إعداد مراسل Gaia luciferase الموسومة فيروس التهاب الكبد C أو جزيئات التهاب الكبد C كما هو مشار إليه في بروتوكول النص.

في أنبوب معقم ، امزج 100 ميكرولتر من 100 ميكرومولار CHLA أو PUG مع 100 ميكرولتر من 10 إلى الرابع. وحدات تشكيل التركيز أو FFU من HCV لمزيج تحكم إيجابي. فيروس التهاب الكبد C مع الهيبارين بتركيز نهائي قدره 1000 ميكروغرام لكل ملليلتر.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ثلاث ساعات ، قم بتخفيف خليط مركب الفيروس 50 ضعفا مع 9.8 مل من الوسط القاعدي في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإعداد خليط مركب فيروسات جديد ، وقم بتخفيف هذا الخليط على الفور في الوسط القاعدي لعينة حضانة ساعة الصفر.

بعد إزالة وسط الحضانة من الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول دواء الفيروس المخفف لكل بئر في ثلاث نسخ. يحتوي المحلول الآن على 10 إلى FFU الثاني لكل بئر يحتضن 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات للسماح بالعدوى الفيروسية للخلايا. بعد الحضانة ، قم بإزالة المعلق الفيروسي من الآبار وغسل الخلايا برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS. مرتين.

احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي لمدة 72 ساعة لتكاثر الفيروس وإطلاق مراسل لوسيفيراز في المادة الطافية. ثم اجمع السوبر من الثقافات والأنابيب الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 17،000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. لإزالة الحطام الخلوي ، امزج 20 ميكرولترا من كل سوبر مع 50 ميكرولترا من كاشف فحص غوسي لوسيفيراز ، وقم بقياس اللمعان من نشاط مراسل لوسيفيراز في مقياس الإضاءة.

وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للوحة فحص المرفق الفيروسي ، مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. في صفيحة بئر 96 واحتضانها طوال الليل لربط الخلية في صباح اليوم التالي. البرد الأول ، صفيحة البئر 96 التي تحتوي على طبقة أحادية الخلية عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

تحضير مركبات الاختبار وخليط الفيروسات على الثلج. على سبيل المثال ، H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1٪ DMSO أو حلول الهيبارين HCV ذات التحكم الإيجابي مع فيروس FFU 10 إلى الثاني. لكل علاج ، قم بشفط الوسط جيدا من آبار زراعة الخلايا برفق.

ثم أضف على الفور 100 ميكرولتر من خليط مركب اختبار الفيروس في آبار ثلاثية النسخ ، مع الحرص على عدم رفع درجة الحرارة. احتضان الطبق في ثلاجة محفوظة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. سوف تلتصق جزيئات الفيروس بالخدمة الخلوية عند أربع درجات مئوية ، ولكن لن يتم استيعابها.

بعد ذلك ، استنشق المواد الطافية اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من الثلج البارد. يضيف PBS 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي إلى كل بئر ، ثم يحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.

أخيرا ، لتحديد كمية إفراج مراسل لوسيفيراز من الخلايا المصابة. اجمع السوبر من كل عينة جيدا وقم بإجراء اختبار Gaussian Luciferase لفحص الاندماج الفيروسي ودخوله. قم بتبريد لوحة زراعة الخلية مسبقا على أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة الليلية لربط الخلية ، قم بإزالة الوسط الموجود من الآبار وإصابة الخلايا ب 10 إلى F-F-U-H-C-V الثاني على الجليد. احتضان اللوحة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المثلج لإزالة الفيروس غير الملتصق ب AD.

ثم على الجليد ، عالج الخلايا بمركبات الاختبار المذابة في الوسط القاعدي أو الوسط القاعدي باستخدام 1٪ DMSO كعنصر تحكم واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. يسمح هذا بتقييم مركبات الاختبار عند دخول الفيروس ، والذي يحدث عند 37 درجة مئوية. استنشق الوسط واغسل الفيروسات غير الداخلية مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من عازلة السترات أو PBS.

أضف 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي لكل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة أخرى. اجمع السوبر وقم بإجراء اختبار Gaussian Luciferase كما هو موضح من قبل للكشف عن مراسل luciferase الذي تم إصداره فيما يلي تأثيرات مركبات الاختبار على HCV. في التنشيط ، تم احتضان الفيروس بمركبات الاختبار لمدة صفر أو ثلاث ساعات قبل الإصابة.

يتم رسم النسبة المئوية لتثبيط العدوى الفيروسية لكل علاج. لا يظهر DMSO الخاضع للرقابة السلبية أي تثبيط. تظهر CHLA تثبيطا عاليا عند الاتصال ، بعد حضانة ساعة الصفر ، وكذلك بعد الحضانة الأطول لمدة ثلاث ساعات.

نتائج إضافية مع اختبار آخر. يتم عرض مركب PUG هنا ، مع تكييف هذا التصميم التجريبي العام ، يظهر أن CHLA و PUG يمنعان أيضا عدوى الفيروس المضخم للخلايا البشرية أو HCMV في الخلايا الليفية الرئوية الجنينية. يظهر هنا تأثير CHLA و PUG على مرفق فيروس التهاب الكبد C.

تذكر أن الخلايا تم تحضينها بالفيروس في وجود أو عدم وجود مركبات الاختبار عند أربع درجات مئوية ، ثم تم احتضان خلايا الفيروس غير المرتبطة عند 37 درجة مئوية للإصابة بالفيروس. توضح القضبان المظللة تأثير C-H-L-A-P-U-G أو الهيبارين على دخول فيروس التهاب الكبد C إلى الخلايا. لاحظ أنه في هذه الحالة ، تم تنفيذ التعلق الفيروسي لأول مرة عند أربع درجات مئوية.

ثم بعد إزالة الفيروس غير المرتبط ، تم تحضين الخلايا بمركبات اختبار عند 37 درجة مئوية لدخول الفيروس. وبالمثل ، في حالة HCMV ، تظهر عدوى علاج الخلايا الليفية الجنينية الرئوية ب CHLA أو PUG تثبيطا قويا للارتباط الفيروسي ودخول الفيروس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تنفيذ الخطوات عند درجة الحرارة المحددة ، مما سيؤثر على دقة النتائج.