فك رموز والتصوير إمراض وحبال من المتفطرة خراج في الزرد الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة ومقارنة ضراوة سلالات المتفطرة الخراجية ووصف التفاعلات بين هذه البكتيريا والجهاز المناعي الفطري المضيف في الجسم الحي باستخدام أجنة الزرد الشفافة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير لقاح بكتيري متجانس أولا. بعد ذلك ، يتم حقن الأجنة عن طريق الوريد بالمعلقات البكتيرية بعد 30 ساعة من الإخصاب.

بالإضافة إلى ذلك ، لدراسة دور البلاعم بشكل أكثر دقة في مكافحة العدوى ، يتم استخدام إجراء الحقن القائم على شوات الدهون لتوليد أجنة مستنفدة من البلاعم. أخيرا ، يتم تحضير الأجنة المصابة وتصويرها باستخدام التألق والفحص المجهري متحد البؤر لمراقبة تطور العدوى. في النهاية ، تظهر النتائج التي يمكن الحصول عليها التفاعلات المحددة بين الخلايا البلعمية الفلورية وخراج M ، إما كقاعدة فردية أو كحبال أفعوانية داخل جنين شفاف.

الميزة الرئيسية لاستخدام أسماك الحمار الوحشي على النماذج الحيوانية الأخرى مثل الفئران هي أنها تسمح بالتحقيق على وجه التحديد في عملية العدوى في الوقت الفعلي ودراسة صورة للتفاعلات المحددة بين خراجات البكتيريا الدقيقة والميكروفاج أو العدلات. هذه الخطوة هي قضية حاسمة لضغط الحقن اللاحق في أسماك الزرد. نظرا للميل العالي للخراج الفطري الخشن لتكوين مجاميع كبيرة وإنتاج أكواد ، لذلك من الضروري إجراء علاج محدد لإعداد عيني متجانس ويتم التحكم فيه كميا قبل الحقن المجهري.

لتحضير م خراج ، حصاد العين تنمو الثقافات بشكل كبير من قوارير زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 150 سم مربع إلى أنابيب بلاستيكية معقمة سعة 50 مليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 4 ، 000 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. استخدم ملليلتر واحد من ميدلبروك سبعة ح تسعة ، مكملا بتخصيب OADC ، بالإضافة إلى توين 80 يشار إليه فيما يلي باسم سبعة H تسعة وسط لإعادة تعليق الحبيبات و Eloqua. 200 ميكرولتر من المعلقات البكتيرية في أنابيب 1.5 مليلتر بإبرة قياس 26 تجانس كل رباعي ALI من التعليق البكتيري 15 مرة.

ثم باستخدام حمام مائي صوتي ثلاث مرات لمدة 10 ثوان لكل منها مع عشر فواصل ثانية. بينهما ، أضف ملليلتر واحد من سبعة H تسعة ، دوامة متوسطة ولفترة وجيزة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 100 مرة G لمدة ثلاث دقائق. اجمع البكتيريا الفطرية التي تحتوي على المواد الطافية بعناية لتجنب التكتلات واسحب المعلقات المتجانسة في أنبوب بلاستيكي معقم سعة 50 مل.

الطرد المركزي التعليق عند 4 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق واستخدم 200 ميكرولتر من سبعة H تسعة وسط لإعادة تعليق الحبيبات لتقييم اللقاح البكتيري النهائي. وفقا لبروتوكول النص ، فإن العرض المرئي لهذه الطريقة ، من الأهمية بمكان أن الخطوات يصعب تعلمها لأن التلاعب الدقيق واللطيف بالحقن في أجنة الزرد تحت المجهر بالإضافة إلى الحصول على تقنية الحقن المجهري يتطلب وقتا لإجراء الحقن المجهري للخراج M في حوالي 24 ساعة. بعد الإخصاب أو HPF ، استخدم الملقط لتغليف الأجنة في طبق بتري 100 ملم واحتفظ بها عند 28.5 درجة مئوية.

انقل 30 48 جنينا من HPF إلى غرفة تحديد المواقع على شكل حرف V مملوءة ب 25 مل من ماء السمك تحتوي على 270 ملليغرام لكل لتر من trica مع طرف محمل صغير مقصوص. ضع الأجنة بشكل صحيح في القنوات لتسهيل التلاعب. استخدم PBST مع 0.05٪ بين 80 لتخفيف لقاح البكتيريا الدقيقة إلى CFU المطلوب ليتم تسليمه وتضمين 10٪ فينول أحمر للتحقق من الحقن المناسب باستخدام طرف اللودر الصغير.

قم بتحميل إبرة الحقن المجهري بخمسة إلى 10 ميكرولترات من اللقاح البكتيري. قم بتوصيل إبرة الحقن المجهري بحامل مناور دقيق متصل بالحاقن ، واستخدم ملاقط دقيقة لكسر الجزء العلوي من الإبرة. للحصول على قطر فتحة من خمسة إلى 10 ميكرومترات.

معايرة حجم الحقن عن طريق ضبط ضغط الحقن الدقيق والوقت. ثم للحصول على حجم الحقن المطلوب ، قم بقياس قطر القطرة التي يتم طردها في صفار جنين واحد للحقن الدقيق في الوريد المهد. ضع الجنين بحيث يكون الجانب البطني مواجها للإبرة وضع طرف الإبرة بالقرب من فتحة الجهاز البولي التناسلي.

وادفع طرف الإبرة برفق إلى الجنين حتى يخترق منطقة الوريد الدلل. ثم قم بتسليم الحجم المطلوب من التعليق البكتيري ، عادة ما يكون من واحد إلى ثلاثة نانولتر يحتوي على حوالي 100 CFU لكل نانولتر. احتضان ومراقبة الأجنة وفقا لبروتوكول النص لتنفيذ lipo Choate ، واستنفاد البلاعم والأجنة بقوة 24 حصان. القدر والأجنة ونقلها إلى طبق حقن مملوء بماء السمك مع التراكا.

ثم قم بتوجيههم من الجانب الظهري إلى أسفل. بعد دوامة محلول كلودرونات مغلف بالجسيمات الشحمية ، قم بتحميل الإبرة الشعرية الدقيقة ومعايرة حجم الحقن. اخترق منطقة الوريد المدلل كما هو موضح سابقا ، وحقن لترات إلى ثلاثة لترات من المحلول.

كرر الحقن ثلاث مرات. احتضان الأجنة عند 28.5 درجة مئوية واستخدم المجهر الفلوري للتحكم في استنفاد البلاعم بشكل صحيح قبل الإصابة. كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو لتعداد وحدات تشكيل المستعمرات أو CFUs في النقطة الزمنية المطلوبة.

اجمع خمسة أجنة لكل حالة إصابة وانقل كل جنين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بالتبريد بتخدير الأجنة عن طريق الحضانة على الجليد لمدة 10 دقائق بعد القتل الرحيم للأجنة ب 300 إلى 500 ملليغرام لكل لتر. تريكا. استخدم الماء المعقم لغسل الأجنة مرتين في أنبوب جديد.

بعد ذلك ، بعد إزالة الماء بنسبة 2٪ Triton X 100 في XPBS واحد لكل جنين ، واستخدم إبرة قياس 26 لتجانس الأنسجة من أجل التحلل الكامل. بعد الطرد المركزي للتعليق ، استخدم X-P-B-S-T لإعادة تعليق الحبيبات. ثم التخفيف التسلسلي للوحة المتجانسة على Middlebrook سبعة H 10 OADC.

مكملا ب B-B-L-M-G-I-T احتضان Panta الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام قبل عد المستعمرات للتصوير الحي لعدوى M الخراج ، الأجنة المخدرة من Mount TRICA في نقطة انصهار منخفضة بنسبة 1٪ في طبق بتري زجاجي قاع 35 ملم لمجهر مقلوب أو شريحة منخفضة تجويف واحد للفحص المجهري متحد البؤر المستقيم. قم بتوجيه الجنين إلى الموضع المطلوب وقم بتغطية الجنين المتصلب بماء السمك الذي يحتوي على التريكا للتصوير الثابت لعدوى خراج M. بعد القتل الرحيم للأجنة ، انقلها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر ، وقم بإصلاح الأجنة في 4٪ ألدهيد Paraform في X-P-B-S-T لمدة ساعتين.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الألدهيد الطلائلي عن طريق غسل الأجنة مرتين باستخدام X-P-B-S-T لمدة 10 دقائق للحفاظ على سلامة الأنسجة والتألق على التوالي. احتضان الأجنة بتركيزات متزايدة من محلول الجلسرين لمدة 10 دقائق لكل حالة. ضع الجنين المضمن في 50٪ من الجلسرين في غرفة العرض.

أخيرا ، استخدم مجهر مضان مع هدف 10 × أو مجهر متحد البؤر الفلوري مع أهداف 40 × أو 63 × للحصول على التألق المتسلسل وتصوير نقل الجنين. للتحقيق في ومقارنة ضراوة متغيرات خراج M الخشنة والناعمة ، تم حقن البكتيريا الفلورية عن طريق الوريد في 30 جنينا بارعا في مركبات الكربون الكلورية عالية الوريد. على النقيض من المتغير السلس ، فإن البديل الخشن يحفز عدوى أكثر قوة وفتكا مع تطور خراجات داخل الجهاز العصبي المركزي.

تم قياس الاختلافات في الفوعة إما عن طريق تعداد CFU ، أو عن طريق تحديد عدد البكسل الفلوري المرتبط. يشير هذا إلى ارتفاع الأحمال البكتيرية للمتغير التقريبي كما هو موضح في هذا الشكل ، يمكن مراقبة حركية تكوين الحبل وتصويرها عن طريق الفحص المجهري بالفيديو بطريقة غير جراحية ، مما يدل على ميل المتغير التقريبي إلى التكاثر خارج الخلية كما هو موضح هنا. تؤدي إصابة الأجنة المستنفدة من البلاعم بخراج M الخام إلى زيادة هائلة في الأحمال البكتيرية وإنتاج الحبل السري وموت اليرقات بسرعة.

يشير هذا بوضوح إلى أن البلاعم مطلوبة للسيطرة على عدوى خراج M لمراقبة التفاعلات بين البلاعم وخراج M في الوقت الفعلي. يمكن استخدام خط الكرز المعدل وراثيا EG one M الذي ينتج البلاعم الفلورية الحمراء. تحفز العدوى تجنيد ملحوظ للضامة مع البلعمة الفعالة للبكتيريا الفردية ، في حين أن الحبال الفطرية تمثل استراتيجية تم تطويرها بواسطة خراجات AM لتجنب البلعمة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف الدور المهم للترميز كآلية جديدة للتهرب المناعي. بفضل شامة الزرد للعدوى ، أصبح من الممكن الآن ملاحظة ووصف مساهمة الرموز في الجسم الحي في التسبب في خراجات المتفطرة.