إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على كسور ميتوكوندرية مخصبة توفر ما يكفي من النواتج الأيضية الميتوكوندرية لإجراء دراسات الميتابولوميات باستخدام ذبابة الفاكهة drosophila melanogaster. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تربية عدد كافٍ من الذباب لتوليد كمية كافية من النواتج الأيضية للكسور الميتوكوندرية المخصبة. وكخطوة ثانية، يتم تجنيس الذباب باستخدام مجانس "تفلون" زجاجي من نوع downs، والذي يعمل على تكسير الغشاء الخلوي دون المساس بسلامة الميتوكوندريا.

تُخضع المتجانسات بعد ذلك إلى عملية طرد مركزي تفاضلي من أجل الحصول على عينات ميتوكوندرية مُثرية. وتُظهر النتائج أنه تم اكتشاف تغيرات استقلابية ميتوكوندرية واضحة باستخدام هذا البروتوكول، والتي لم يتم اكتشافها باستخدام تحليل الميتابولوميات القائم كلياً على الكسور الميتوكوندرية المثرية ومستخلصات الحيوان الكاملة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا الإجراء مقارنة بتحليل الميتابولوميات للذبابة الكاملة في أن عزل الميتوكوندريا قبل تحليل الميتابولوميات يسمح بزيادة الحساسية واكتشاف التحول في المستقلبات الميتوكوندرية.

لبدء التجربة، قم بتسخين مكونات غذاء الذباب على لوح تسخين عند 90 درجة مئوية. قم بتقليب الخليط بانتظام حتى يصبح متجانساً وكثيفاً قليلاً. ارفع الغذاء عن مصدر الحرارة وقم بتقليبه من حين لآخر عندما يبرد الغذاء إلى 80 درجة مئوية، ثم أضف 0.2%TE decept methyl four hydroxy benzoate المذاب في 95%Ethanol، بعد ذلك، قم بتقسيم الغذاء إلى حجمين متساويين.

تأكد من انخفاض درجة حرارة الطعام إلى 50 °C، ثم قم بتحريك 1.1 mL من rapamycin بتركيز 50 mM المذاب في الإيثانول في الحجم الأول، و 1.1 mL من الإيثانول غير المعالج في الحجم الثاني. لجمع البالغين، استخدم منظم مرحلة واحدة لتوصيل ثاني أكسيد الكربون النقي من خزان عالي الضغط. وعند تدفق مستمر قدره خمسة PS، أتجنب الكهرباء الساكنة باستخدام أنبوب بلاستيكي لنقل ثاني أكسيد الكربون إلى دورق ترشيح سعة 500 mL مع وجود أنابيب لفقاعة ثاني أكسيد الكربون عبر الماء.

للقيام بذلك، استخدم سدادة مطاطية ذات ثقب واحد لإغلاق القارورة. قم بتوصيل أنبوب بلاستيكي من الفتحة الجانبية للقارورة بـ carbon dioxide pad للتحكم في كثافة اليرقات أثناء النمو. ضع 25 زوجاً من الآباء في زجاجة استزراع واتركهم لوضع البيض لمدة 48 ساعة.

بعد ذلك، يتم إزالة الآباء لتنظيم كثافة البيض وتكرار هذه الخطوات باستخدام نسل F1 الناشئ لتحقيق جيلين من التحكم في هذه الكثافة. وبعد مرور جيلين تحت ظروف التحكم في الكثافة، تُفصل الذباب حسب الجنس، مع وضع الذباب على وسادة التخدير لمدة لا تزيد عن 10 إلى 15 دقيقة. ثم يُترك الذباب للتعافي من التخدير لمدة 24 ساعة قبل وضعه في الظروف التجريبية.

خصص 300 ذبابة لكل عينة لإنتاج ما يكفي من النواتج الأيضية للأجزاء المثرية بالميتوكوندريا. انقل 150 ذبابة إلى قفص منزلي الصنع سعة لتر واحد. ثم انقل الـ 150 ذبابة المتبقية إلى قفص منفصل سعة لتر واحد، واحرص على عدم زيادة عدد الذباب في الأقفاص عن 150 ذبابة.

استخدم ست عينات مكررة لكل حالة تجريبية، وضع الأقفاص عند درجة حرارة 25 °C في دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة لإتمام تربية ذباب Drosophila. زود الذباب بغذاء طازج كل يومين أو ثلاثة أيام في أنبوب يحتوي على 5 mL من الغذاء للحفاظ على جودته لمدة إجمالية تصل إلى 10 أيام. ابدأ عملية العزل عن طريق تفريغ الذباب من قفص واحد في مجانس تفلون زجاجي متجه للأسفل مملوء بـ 1 mL من محلول العزل المنظم المبرد.

بعد ذلك، ضع الهاون على الثلج للحفاظ على سلامة المتقدرات (mitochondria)، وقم بتجانس الذباب عبر 15 ضربة. مع الحرص على عدم تدوير المِدفكة، انقل المستحلب إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter وقم بطرد الأنبوب مركزياً عند 300 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. انقل الراشح إلى أنبوب آخر وقم بطرده مركزياً عند 6,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C لإثراء المتقدرات.

بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الطافي الذي يحتوي على الجزء السيتوزولي. قم بإعادة تعليق الراسب في 300 microliters من محلول الغسيل المنظم عن طريق السحب والضخ بالماصة. كرر الخطوات السابقة برفق للمرة الثانية.

بعد ذلك، اجمعي الكريات المعاد تعليقها من كلا القفصين في أنبوب طرد مركزي ميكروي مبرد، ثم قومي بطرد الكريات المجمعة مركزياً عند 6,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. تخلصي من السائل العلوي وقومي بتجميد الكريات سريعاً في النيتروجين السائل. وأخيراً، خزني الأجزاء المثرية بالميتوكوندريا عند درجة حرارة -80 °C.

يظهر تحليل اللطخة الغربية (western blot) هذا إثراءً لبروتين نقل غشاء الميتوكوندريا poin، والذي يعمل كمؤشر على الفصل الفعال للميتوكوندريا في كسور الميتوكوندريا. لا يمكن الكشف عن بروتين Poin في الكسور السيتوسولية، بينما لا يتم الكشف عن بروتين tubulin، وهو بروتين أنبيبات دقيقة سيتوسولي، في كسر الميتوكوندريا، مما يثبت الحد الأدنى من التلوث بالبروتينات السيتوسولية. تم إنشاء تحليلات المكونات الرئيسية أو PCA باستخدام القيم الناتجة عن تحليل مطياف الكتلة التي تمت معايرتها وفقاً لتركيز بروتين Bradford، وتحويلها لوغاريتمياً، واستبدال القيم الدنيا الملحوظة لكل مركب.

تم إنشاء مخططات تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام الملفات التعريفية الكاملة للمستقلبات. تختلف الملفات التعريفية لسلالات الذباب الأصلية والمعطلة فيما يخص مستقلبات الحمض النووي الميتوكوندري التي تم الحصول عليها من مستخلص الذبابة الكامل القياسي عند مقارنتها بمخطط PCA للمستقلبات في المستخلصات المخصبة بالميتوكوندريا؛ حيث تنفصل الملفات التعريفية للمستقلبات من الذبابة الكاملة تماماً على طول محور المكون الرئيسي الثاني (PC axis two)، وهو ما يعكس التأثيرات الرئيسية لمعالجة الراباميسين. ولا توجد سوى اختلافات طفيفة بين الأنماط الجينية البديلة لـ M-T-D-N-A.

في المقابل، تُظهر ملفات المستقلبات المستخلصة من المستخلصات الغنية بالميتوكوندريا انفصالاً بين النمط الجيني M mt DNA الأصلي الذي يتغذى على غذاء عادي والعينات الثلاث الأخرى، وهي MTD NA الأصلي المعالج بالراباميسين، وMTD NA البديل سواء على الغذاء العادي أو الراباميسين. وهذا يشير إلى أن تأثير MTD NA البديل يزيح ملفات المستقلبات بطريقة مماثلة لتأثيرات العلاج بالراباميسين. وأثناء تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم والموصى به إجراء جميع عمليات الاستخلاص في نفس اليوم، لتقليل التباين بين المكررات.

سأوصي بإعداد خطة مسبقة وتسمية الأنابيب، ومتابعة سجلات الانتظار بين المكررات لتحسين جودة تحضير العينات لدينا.