Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)

الهدف العام من تقنية الفحص المجهري هذه هو تصور تفاعلات البروتين والبروتين على مقياس الجزيء الفردي والنانومتر. لذلك يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء ، مثل التفاعلات الجزيئية في عمليات الإشارات المسرطنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها حساسة ومحددة وتوفر دقة جزيء واحد ونانومتر.

سيوضح الإجراء الدكتور طهان ، وهو باحث كبير مرتبط في مختبري بعد استنساخ RAs و RAF R-B-D-P-A-M يقوم الكرز بتقطيع العبوة إلى جزيئات فيروسية وإصابة خلايا U2 OS وفقا لبروتوكول النص. لإعداد عينة للوحة التصوير حوالي 5.5 مرات 10 إلى خلايا التعبير المستقرة الرابعة لكل بئر من ثمانية آبار زجاج أسفل غرفة انزلاق في 350 ميكرولتر من الفينول الأحمر الحرة DMEM. استخدم البارالديهايد الطازج مع الجلوتارالديهايد لإصلاح الخلايا وبعد استبدال المثبت ب PBS أو دوامة العازلة للتصوير جزيئات ذهبية 100 نانومتر وإضافة 35 ميكرولتر لكل بئر لتتبع انجراف المرحلة أثناء التصوير.

اقترب من المجهر والطاقة على الليزر 405 و 561 نانومتر مع إبقاء المصاريع مغلقة في هذه المرحلة ، وتأكد من وجود مرآة ثنائية اللون 561 نانومتر ومرشح الشق في مكانهما. افتح برنامج الحصول على الصور. قم بتشغيل كاميرا E-M-C-C-D واتركها تبرد واضبط وقت التعريض الضوئي على 100 مللي ثانية وكسب E-M-C-C-D على قيمة مناسبة.

أضف زيت الغمر إلى الهدف وقم بتأمين العينة على عمر مرحلة المجهر. بعد ذلك ، باستخدام الليزر الساطع أو الليزر 561 نانومتر ، ضع العينة في بؤرة التركيز لتصوير RAs وبروتينات الغشاء الأخرى. استخدم هدف عشب كرومات APO 60 × بفتحة عددية 1.49 وقم بإحضار المجهر إلى تكوين العشب.

اضبط ليزر الإثارة بحيث يكون بعيدا عن المركز عند ضرب الفتحة الخلفية لهدف العشب ، مما يؤدي إلى انحراف الليزر عند الوصول إلى عازلة انزلاق الغطاء في الوجه. استمر في ضبط موضع حادث الليزر حتى يتم الوصول إلى الزاوية الحرجة وانعكاس الليزر مرة أخرى. ابحث عن خلية لتصويرها مع عرض العديد من جزيئات الذهب.

ثم قم بتعيين منطقة اهتمام تحيط بالخلية أو منطقة منها وجزيئات الذهب في حالة حدوث تنشيط كاف بالفعل بسبب مستويات التعبير العالية. ابدأ الاستحواذ مع إيقاف تشغيل الليزر 405 نانومتر وتشغيل الليزر 561. خلاف ذلك ، قم بتشغيل الليزر 405 نانومتر بأقل إعداد لطاقة المصنع وزيادته تدريجيا حتى يكون هناك عشرات الجزيئات لكل إطار أو بحيث يتم فصل الجزيئات المفردة جيدا.

مع استمرار الحصول على البيانات ، قم بزيادة طاقة الليزر 405 نانومتر تدريجيا للحفاظ على كثافة البقعة ثابتة تقريبا. استمر في الحصول على الصورة حتى ارتفاع 4 0 5. الطاقة لا تبدأ بعد الآن.

تنتهي أحداث التنشيط بمعالجة الصور. قم بتنزيل برنامج معالجة الصور. افتح MATLAB وقم بتحميل برنامج قراءة WFI.

اعرض تسلسل الصورة الأولية وحدد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار حدد منطقة المكدس المراد معالجتها بالنقر بزر الماوس الأيسر وسحبه حول المنطقة المطلوبة. إذا لم يتم تقليل منطقة الاهتمام أثناء الاستحواذ، فحدد مساحة أصغر لتقليل وقت الحوسبة لإلغاء تحديد منطقة ومعالجة الإطار بأكمله انقر بزر الماوس الأيمن في أي مكان في الصورة بجوار تحديد مجموعة من العلامات الائتمانية مثل الجسيمات النانوية الذهبية الممتصة على زلة الغطاء المعزولة جيدا والموحدة والشكل والموجودة في مجال الرؤية في جميع أنحاء مكدس الصور. ابدأ باختيار جسيم ذهبي مرشح عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على صورته وسحب مربع صغير حوله.

ضمن تتبع الجسيمات، انقر فوق زر المسار. سيظهر رسم بياني يوضح موضع جسيم الذهب المحدد عبر كومة الصور التي تصور مدى الانجراف. كرر هذه العملية لتتبع أكبر عدد ممكن من جزيئات الذهب وتحديد الجسيمات التي تتعقب معا. الناحيه المثاليه.

يبلغ حجم الانجراف الكلي 0.1 بكسل على الأكثر ، واحدا تلو الآخر. حدد جزيئات الذهب التي تم تتبعها معا وتحت تتبع الجسيمات. انقر فوق الزر إضافة علامة.

سيظهر صليب أخضر يدل على أن الجسيم قد تمت إضافته كعلامة وسيتم استخدامه لتصحيح الانجراف. اضبط نطاق تجانس نطاق سيجما وعتبة حسب الضرورة عن طريق تغيير القيمة قليلا. انقر فوق الزر "البحث عن الجسيمات" لاختبار الإعدادات وفحص جزيئات العملية بصريا مثل جزيئات الكرز PAM ، وسيتم وضعها في الصندوق وتلك التي ليست كذلك.

لبدء معالجة الصور ، انقر فوق الزر إنشاء ملف سلك واحفظ الملف تحت الاسم المطلوب لمعالجة الصور بعد ذلك وعرض صورة راحة اليد. قم بتشغيل حزمة راحة اليد في MATLAB ، وقم بتحميل ملف النقطة الأساسية الذي تم إنشاؤه للتو. ستظهر صورة معروضة بالطبع في مربع الصورة بجوار أزرار التحكم.

قم بفرز الإحداثيات الفردية باستخدام القيم النموذجية التالية. بالنسبة إلى PAM Cherry واحد ، فإن الإطار المدمج يساوي ثمانية. الجمع بين المسافة بالنانومتر يساوي 100 RMS كحد أدنى يساوي أربعة.

الحد الأدنى للملاءمة الجيدة يساوي 0.25 والحد الأقصى للانحراف يساوي 1.4. انقر فوق زر الفرز لإنشاء مجموعة جديدة من الإحداثيات المنسقة الجاهزة لعرض صور عالية الدقة. أدخل قيما للعرض المناسب للصورة النهائية، مثل حجم البكسل الخام كما هو محدد مسبقا لحجم الميزة المطلوب في الصورة المعروضة، والذي يتم تعيينه عادة بقيمة أعلى قليلا من متوسط الترجمة وحجم البكسل مثل 10 نانومتر.

بالنسبة للصورة المعروضة ، انقر فوق زر العرض لإنشاء صورة راحة اليد. ثم استخدم أيقونات التكبير زائد والطرح في شريط أدوات نافذة الشكل للتكبير والتصغير لتتبع الجزيئات المفردة في الخلايا الحية. عالج سطح زراعة الأنسجة وقم بلوحة الخلايا كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو.

تأكد من أن زجاج الغطاء يحتوي على السماكة المناسبة للفحص المجهري الذي تم إعداده بعد نقل الخلايا وإجراء أي علاجات وحضانات مطلوبة للتجربة ، ضع طبق الثقافة على حاضنة على خشبة المسرح. اترك الطبق يستقر على المسرح لبضع دقائق حتى تستقر درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون2 يستقر التركيز في هذه الخطوة. منع الليزر.

إذا لم يكن التحكم في ثاني أكسيد الكربون متاحا ، فقم بالتغيير إلى وسيط مستقل من ثاني أكسيد الكربون مباشرة قبل التصوير مثل الليزر L 15 للضغط على تألق الخلفية أخيرا للحصول على الصور كما هو موضح سابقا ، وتعيين وقت التعرض المناسب لضمان نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء دون فقدان دقة الوقت. كف BFC في هذا الشكل هو متحولة KRAS G 12 D التي تتفاعل مع مجال ربط RAs أو RBD ل CRAF. تم إدخال كل من المجموعات الأربع الموضحة هنا في خلايا U2 OS باستخدام خلايا العدوى الفيروسية مع اثنين من التكوينات لهما إشارات BFC إيجابية قوية كما تم تحديده من خلال الزيادة المفاجئة في التألق عندما تم تشغيل الليزر 405 نانومتر بسبب التنشيط الضوئي ل BFC المعاد تكوينه PAM Cherry واحد كما هو موضح هنا باستخدام نفس الإعدادات التجريبية كما هو الحال مع PAM Cherry الأصل واحد.

تم إنشاء إشارة BFC قوية بعد الإصابة ب RN R و RAF RBD RC. هنا ، يشير RN و RC إلى الجزء الطرفي n و C من PAM Cherry one على التوالي عند تكبير الجزيئات الفردية ويمكن رؤية توزيعها المكاني على نطاق نانوي بوضوح في هذه التجربة حيث تم إجراء راحة اليد لتتبع الجزيء الفردي للحصول على مسارات انتشار RAs الفردية. مجمعات سلاح الجو الملكي البريطاني RBD تحت إضاءة مستمرة مع ليزر 561 نانومتر و 405 نانومتر. فردية [ب] [م] كرز واحدة جزيئات ش.

قم بتشغيلها واستمرارها لبضعة إطارات قبل الدخول إلى الحالات المظلمة حيث وجد أنها إما غير متحركة أو متنقلة. توضح مخطط التسجيلات هذه لجزيئات متعددة بوضوح كلا النوعين من المسارات. يمكن استنتاج نفس التوزيع غير المتجانس لحالات الانتشار من الرسم البياني لإزاحة الجزيء بين الإطارات المتتالية التي تتقن الكتلة.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوع إلى ثلاثة أسابيع ، اعتمادا على ما إذا كانت التركيبات متسامية أو متحولة أو مضطهدة بثبات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد عناصر تحكم مثل Putins المتحولة التي تفتقر إلى التفاعل بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التحليل العنقودي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف يتم تنظيم تفاعلات البروتين مكانيا في الخلية؟

لتتبع خلايا المختبر ، يمكن إجراء قاعدة تقييمية ، تتبع جسيم واحد لتحديد حالات الانتشار واحتمالات الانتقال بعد تطورها. يتم استخدام هذه التقنية في مختبرنا في مجال بيولوجيا السرطان لاستكشاف تفاعلات محرك RA بالإضافة إلى homo وتكوين مستقبلات عائلتها في الخلايا السرطانية البشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتنفيذ خزعة راحة اليد للتحقيق في تفاعل البروتين ذي الأهمية.

لا تنس أن العمل مع برامج مكافحة الفيروسات والخلايا السرطانية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل بروتوكولات السلامة الحيوية القياسية عند تنفيذ هذا الإجراء.