باستخدام تحليل متحد البؤر من

الهدف العام من هذه المنهجية هو تصور إفراز وانتشار اللجينات (ligands) الموَّسمة فلورياً في ظهارة سليمة باستخدام التعبير الجيني في xip pos lavis. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول إنشاء تدرجات morpho التي من المعروف أنها أساسية في تحديد السلالات الخلوية أثناء التطور الجنيني المبكر. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها طريقة بسيطة لتصور توزيع اللجينات في ظهارة سليمة.

يُعد توليد ربيطات نشطة بيولوجياً جزءاً أساسياً من البروتوكول، بحيث يتم معالجتها وإفرازها بشكل طبيعي وتكون قادرة على إثارة استجابة في الخلايا المستقبلة على الرغم من وجود علامة فلورية متصلة بها. ويُعد المجهر البؤري (Confocal microscopy) وسيلة مثالية لدراسة تموضع البروتينات ذات العلامات الفلورية داخل الأنسجة ثلاثية الأبعاد، حيث تتيح الليزرات والكواشف المستقلة إجراء تحليل دقيق ضمن هذه الأنواع المعقدة من الأنسجة، مما يسمح بجمع بيانات قوية. بعد توليد تغطية mRNA للربيطات ذات العلامات الفلورية والحصول على أجنة XUS lavis وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم حقن mRNA جنباً إلى جنب مع متتبع السلالة مثل membrane RFP، في خلية واحدة في مرحلة 16 إلى 32 خلية؛ وإذا رغب الباحث، يمكن حقن مُعدِّل (modulator) مع الربيطة الفلورية وعلامة السلالة لتحليل تأثيراته.

يكون من المفيد أحيانًا حقن خلية مجاورة أيضًا، وهنا يتم حقن خلية ثانية بجوار الخلية التي تم حقنها مسبقًا. تُحقن إحدى الخلايا بـ mRNAs التي تشفر للربيطة الملحقة بـ GFP ومقتفي سلالة مثل membrane RFP، بينما تُحقن الخلية الأخرى بـ mRNAs التي تشفر للمعدل ومقتفي سلالة مختلف مثل membrane cerulean. تُنقل الأجنة إلى حاضنة بدرجة حرارة 12.5 درجة Celsius وتُزرع حتى تصل إلى مرحلة new coop. في مرحلة Faber stage eight، في اليوم التالي، عندما تصل الأجنة إلى stage eight، تُملأ الأطباق المطلية بـ 1%aros بـ NAM two وتُنقل الأجنة باستخدام ماصة زجاجية مقطوعة وباستخدام إبر تنجستن.

قم بتشريح سدادات دائرية من القطب الحيواني للأجنة المحقونة وأجنة المجموعة الضابطة، مع الحرص على عدم تضمين أي من الأديم المتوسط. انقل السدادات الحيوانية إلى أطباق بتري بقطر 55 مليمتر، مطلية بـ 1%aros، وازرع الأجنة لمدة أربع ساعات للسماح للبروتينات الفلورية بالنضج من أجل توليد تضاريس. لتحضير الشرائح، ضع طبقتين من شريط عزل PVC على شرائح المجهر مع تسطيحهما تماماً.

قص مستطيلاً بأبعاد 14 في 10 مليمتر من الشريط المخصص لتثبيت القبعات الحيوانية. بعد ذلك، انقُل قطرتين منفصلتين من NM two إلى شريحة التrelief باستخدام الماصة. ثم، وباستخدام طرف P 20 مقطوع، انقل ما يصل إلى 15 explant حيواني إلى كل شريحة، وباستخدام الملقط، وجّه الـ X explants بحيث يكون الجانب القمي متجهاً للأعلى.

باستخدام قلم ماسي، قم بخدش شريحة غطاء زجاجية ثم اكسرها لإنشاء شريحة غطاء أصغر. لتركيبها على شريحة التثبيت (relief slide)، أنزل شريحة الغطاء الزجاجية برفق فوق شريحة التثبيت باستخدام إبرة مثنية قياس 19 gauge، وذلك لضغط الطبقة القمية لخلايا القبعة الحيوانية.

استخدم طلاء الأظافر لختم الشريحة وتركها تجف في الظلام لمدة 20 دقيقة، ثم قم بالتصوير خلال أربع إلى ست ساعات. ولضمان سلامة القبعات الحيوانية، يجب توجيه القبعات الحيوانية بشكل صحيح في الشرائح المخصصة ثم تحت أغطية الشرائح. قم بتحميلها على الشرائح برفق.

من الضروري عدم استخدام كمية كبيرة من طلاء الأظافر لسد الشرائح، لأن ذلك سيؤدي إلى تجعد الشريط ومن ثم كسر الختم على الشريحة لاحقاً. وبمجرد إتقان هذه العملية، سيتعين عليك حقن حوالي 25 جنيناً من أجل الحصول على 20 غطاءً حيوانياً جيداً لكل حالة تهتم بدراستها. ويمكن بعد ذلك تحليل هذه العينات باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) في اليوم التالي.

لإجراء التصوير، استخدم عدسة شيئية ذات تكبير منخفض للعثور على X explan. ثم انتقل إلى عدسة زيتية 63 x 1.4 للحصول على تصوير بدقة أعلى. قم بتشغيل الليزرات المطلوبة بما في ذلك 405 لـ MIAN و 488 لـ GFP و 561.

بالنسبة لـ MRFP، قم بتحسين قدرات الليزر بحيث يمكن الكشف عن جميع الفلوروفورات. استخدم مصفوفة الكاشف 32 مع تقليل مقدار الجهد والربح المطلوبين، ثم استخدم وضع Lambda وحدد ليزرات 405 nanometers و 488 و 561 nanometer. وللسماح بمجال رؤية أوسع، قم بتصغير تكبير الصورة إلى 0.6 x.

بعد ذلك، اضبط حجم الإطار ليتناسب مع حجم الصورة المطلوب. يوفر هذا دقة كافية للتحليل مع ضبط متوسط التجميع من أربعة إلى ثمانية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضجيج وتحسين فتحة الثقب (pinhole) لمجموعة البيانات هذه. تم استخدام وحدة مساحة واحدة، وفقاً لليزر 561 نانومتر، باستخدام 405 و 488 و 561.

تقوم مرايا Diic بتجميع الضوء المنبعث من Saru الغشائي، وGFP، وRFP الغشائي. في هذه التجربة، تم تجميع الضوء كل 10 nanometers تقريباً من 415 إلى 720 Nanometers. قم بإجراء تحليل الصور وفقاً للبروتوكول النصي الموضح هنا؛ هذا هو توزيع sonic hedgehog المسمى بـ GFP في جنين حيواني (cab X) تحت ظروف التحكم؛ حيث يتم إفراز sonic hedgehog GFP وينتشر خارج المنطقة التي تعبر عن mRNAs المحقونة.

ومع ذلك، في وجود المُعدِّل SULF1، يكون توزيع Sonic Hedgehog GFP أكثر تقييداً. وفي هذه العينة، يمكن رؤية عدد قليل فقط من بؤر Sonic Hedgehog GFP على مسافة قصيرة من مستنسخة الخلايا المنتجة له. يوضح هذا الشكل توصيف اثنين من ربيطات Wnt الموُسمة بفلوريسنت والتي تم حقنها في الخلايا كما هو موضح هنا، حيث يتراكم كل من Wnt8a و Wnt11b-HAE-GFP على غشاء خلايا القبعة الحيوانية، مع تراكم Wnt8a-HAE-GFP بكفاءة أكبر من Wnt11b. يوضح هذا الشكل توزيع Wnt8a-HAE-GFP المُعبَّر عنه في مستنسخة من الخلايا الموُسمة ببروتين Cerulean المرتبط بالغشاء.

يُلاحظ انتشار الربيطة الموُسمة فلوريسنتياً بعيداً عن الخلايا المصدر وإلى الخلايا المحيطة بها في الظهارة. يُستخدم برنامج تحليل الصور لاستخراج بيانات حول توزيع ربيطات wind الموُسمة فلوريسنتياً في عينات تجريبية متعددة كما هو موضح هنا. يتم قياس المسافة من مستنسخ Saru المُعبر والـمستوى الخاص بفلورية GFP لتحديد نطاق انتشار wind وشكل التدرج.

بعد قياس توزيع الربيطة، يمكن أيضاً تقييم مخرجات مسار تأشير من خلال دمج هذا البروتوكول مع مقايسة أخرى لمراقبة استجابة الخلايا المستقبلة. وبهذه الطريقة، يمكنك محاولة تحديد نطاق العتبة لمورفوجين ما.