بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

الهدف العام من هذا الإجراء هو استعادة جزيئات فيروسية معدية مُصنعة بالكامل من cDNA مستنسخ لفيروسات RNA ذات الشريط الموجب، والتي تكون جينوماتها بنفس قطبية mRNA الخلوي، مثل فيروس التهاب الدماغ الياباني. تُعد الوراثة العكسية القائمة على cDNA طريقة جوهرية تتيح التلاعب المباشر بـ RNA الجينومي الفيروسي، مما يسمح بتوليد فيروسات مأشوبة للدراسة الجزيئية والوراثية في تضاعف الفيروسات وإمراضيتها. كما توفر هذه التقنية منصة قيمة تسمح بتطوير ناقلات فيروسية من نوع vaccinia محددة وراثياً لإيصال جينات غريبة.

تُطبق هذه الطرق لاستنساخ cDNA كامل الطول للسلالات السالبة أو الموجبة، والفيروسات ذات الرنا (RNA)، لا سيما تلك التي تزيد أحجام جينوماتها عن 10 kb. سيقوم بتوضيح الإجراء عدة أعضاء من مختبري، وهم مساعد الأبحاث Sang-Im Yun، وزملاء ما بعد الدكتوراه Byung-Hak Song وJin-Kyoung Kim، وطالب المرحلة الجامعية Jordan Frank.

يغطي الجزء المرئي من هذا المنشور تحضير الكروموسوم الاصطناعي البكتيري الذي يحتوي على التسلسلات المطلوبة، وتخليق RNA المنسوخ من البلازميد الخلفي، وكيفية قياس قدرة الـ RNAs على العدوى، وإنتاجية الفيروس. جميع الإجراءات المستخدمة قبل توليد بلازميد BAC مفصلة بدقة في البروتوكول النصي. لهذا الإجراء، قم أولاً بتنمية مستعمرة واحدة من E. coli DH10B، الحاملة لبلازميد BAC في ثلاثة ملليلترات من مرق 2X YT مع الكلورامفينيكول. قم بحضن المزرعة لمدة 10 ساعات عند 35 درجة مئوية مع الرج بسرعة تتراوح من 225 إلى 250 RPM.

بعد مرور 10 ساعات، يتم زيادة حجم المزرعة. ثم يتم تلقيح 500 µL من المزرعة في 500 mL من الوسط الغذائي وتنمية اللقاح لمدة ست ساعات مع الرج القوي. وبعد ست ساعات، يتم طرد المزرعة البكتيرية مركزياً في زجاجتين سعة 250 mL بسرعة 3,100 g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. ثم يتم إعادة تعليق كل راسب في 30 mL من محلول GTE.

أضف 500 µL من الليزوزيم واحضن المعلقات على الثلج لمدة 10 دقائق. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول تحلل طازج للخطوة التالية. بعد مرور 10 دقائق، أضف 60 mL من محلول التحلل واخلط عن طريق التدوير حتى يصبح المحلول رائقاً.

اترك التفاعلات تستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 minutes. بعد ذلك، أضف 45 milliliters من محلول التعادل إلى كل زجاجة واقلب الزجاجات حتى تختلط المكونات جيداً. ثم ضعها على الثلج لمدة 10 minutes.

اجمع المستخلصات المتعادلة باستخدام الطرد المركزي المبرد عالي القوة g. بعد ذلك، اجمع السوائل الطافية في زجاجتين جديدتين سعة 250 milliliter. أضف 0.6 أحجام من الإيزوبروبانول 100% إلى كل منهما وضعهما على الثلج لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بطرد الرواسب مركزياً لترسيبها، ثم تخلص من السوائل الطافية وأذب الكتل المترسبة في 5 milliliters من محلول TE المنظم. ادمج الحجمين في أنبوب واحد سعة 50 milliliter وقم بترسيب الـ RNA عن طريق إضافة حجم مساوٍ من كلوريد الليثيوم بتركيز 5 molar وتحضين الخليط على الثلج لمدة 10 minutes. استخدم الطرد المركزي البارد لمدة 20 minute لجمع راسب الـ RNA.

بعد ذلك، يتم نقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد سعة 250 milliliter، ويُضاف إليه حجمان من الـ isopropanol بتركيز 100%، ثم يوضع الأنبوب على الثلج ليتشكل راسب الـ DNA. وبعد مرور 20 دقيقة، يتم تدوير الراسب باستخدام جهاز الطرد المركزي، ثم سحب السائل الطافي، وإعادة تعليق كتلة الـ DNA في 9.5 milliliters من محلول TE buffer، ثم نقل محلول الـ DNA إلى أنبوب سعة 50 milliliter.

استكمل عملية التحضير من خلال إعداد تدرج كلوريد السيزيوم مع بروميد الإيثيديوم. قم بتحميل الخليط في أنبوب بولي بروبيلين قابل للإغلاق باستخدام سرنجة ذات إبرة قياس 18 gauge ثم أغلق الأنبوب بإحكام. قم بتدوير الأنبوب المغلق طوال الليل في جهاز طرد مركزي فائق السرعة لتشكيل تدرج كلوريد السيزيوم.

في اليوم التالي، قم بجمع حزمة DNA من بلازميد BAC من تدرج كلوريد السيزيوم. استخدم إبرة قياس 18 gauge لعمل فتحة تهوية في الجزء العلوي من التدرج، وإبرة قياس 20 gauge مع سرنجة لجمع BAC DNA من جانب التدرج، ثم انقل العينة المجموعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 milliliter. قم بإجراء عملية غسيل، حيث تضف 2.5 من أحجام البوتانول المشبع بالماء واخلط المزيج باستخدام جهاز vortex العادي.

ثم قم بطرد الخليط مركزياً في درجة حرارة الغرفة وانقل الطور المائي السفلي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 milliliter. كرر عملية الغسل هذه ست مرات إجمالاً لإزالة كل بروميد الإيثيديوم. الآن قم بترسيب BAC DNA. أضف إلى الأنبوب حجماً يعادل 1/10 من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 molar و2.5 حجماً من الإيثانول بتركيز 100%. حضّن الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم قم بطرد الراسب مركزياً في درجة حرارة الغرفة واغسل قرص DNA بـ 1 milliliter من الإيثانول بتركيز 70%. كرر عملية الطرد المركزي واجمع القرص مرة أخرى. وأخيراً، جفف قرص DNA في الهواء لمدة 10 دقائق واستخلص الحمض النووي في 200 microliters من محلول TE buffer.

ابدأ بعملية هضم واسعة النطاق لبلازميد BAC باستخدام إنزيم القطع Xba-one في حجم إجمالي قدره 100 µL. يتم إجراء هذا الهضم عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 12 إلى 15 ساعة. بعد ذلك، يتم تحضين ناتج الهضم بشكل إضافي مع 25 units إضافية من نوكلياز Mung-bean عند درجة حرارة 30 °C لمدة ساعتين.

بعد فترة التحضين، أكمل الحجم إلى 300 µL باستخدام الماء المقطر. قم الآن بإجراء استخلاص بالفينول عن طريق إضافة حجم مساوٍ من خليط الفينول-كلوروفورم وكحول الإيزواميل إلى العينة المخففة، ثم رج الأنبوب بقوة باستخدام جهاز الفورتكس لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بطرد مركزي للأنبوب ونقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد.

ثم كرر عملية الاستخلاص باستخدام الكلوروفورم. بعد ذلك، استعد الحمض النووي BAC المخطط عن طريق الترسيب باستخدام الإيثانول. اجمع كتلة الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي واغسل الكتلة بـ 1 ml من الإيثانول بتركيز 70%. كرر خطوة الطرد المركزي وجفف الكتلة في الهواء. بعد 10 دقائق من التجفيف، أذب كتلة الحمض النووي في 30 µL من الماء المقطر. ثم افحص 1 µL من الـ BAC المستعاد على هلام أغاروز بتركيز 0.8%.

بعد ذلك، قم بإعداد تفاعل نسخ مفرغ (runoff transcription) بحجم 25 µL من حمض BAC DNA الخطي، مع إضافة tritiated-UTP لتقدير كمية RNA. أجرِ التفاعل عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. ثم افحص 1 أو 2 µL من ناتج تفاعل النسخ المفرغ باستخدام هلام أغاروز بتركيز 0.6%.

ابدأ باستخدام خلايا BHK-21 التي تم إنماؤها لمدة 24 ساعة في أطباق بقطر 150 مليمتر، بمعدل 3 مليون خلية لكل طبق. اشطف الطبقة أحادية الخلايا باستخدام المحلول A البارد، ثم افصل الخلايا عن طريق التربسين (trypsinization). اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 270 g لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 50 milliliters من المحلول A البارد ثم قم بطردها مركزياً مرة أخرى. كرر عملية الغسل هذه ثلاث مرات. وبعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا بتركيز 20 مليون خلية لكل milliliter في المحلول A. ثم اخلط جزءاً مقداره 400 microliter من معلق الخلايا مع 2 micrograms من الـ RNA الاصطناعي في كوفت measuring cuvette سعتها 2 millimeter.

قم بإجراء التثقيب الكهربائي للمزيج على الفور تحت الظروف المثلى، واترك الخلايا لترتاح لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 600 µL من وسط زراعة كامل. الآن، قم بإعداد تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي في أحجام تبلغ 1 mL. ازرع حصصاً بمقدار 100 µL من كل تخفيف على طبقات أحادية من خلايا BHK21 الطبيعية. بعد فترة حضانة تتراوح من أربع إلى ست ساعات، قم بتغطية الخلايا بطبقة من 0.5% agarose في وسط MEM مضاف إليه FBS واستزرعها لمدة أربعة أيام أخرى.

تم إجراء تثقيب كهربائي وهمي لخلايا BHK21 أو تثقيب كهربائي باستخدام نسخ RNA مشتقة من نسيلتين مستقلتين من JEV-BAC كامل الطول. وبعد مرور أربعة أيام، صُبغت الخلايا بالبنفسج البلوري (crystal violet) لمشاهدة الـ RNA المعدي داخل الخلايا. وباستخدام هذه الصبغة، تم قياس المراكز المعدية كمياً. بعد ذلك، فُحص تعبير البروتين الفيروسي في الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي بـ RNA بعد 20 ساعة من ترانسفكشن (transfection) باستخدام مصل أرنب مضاد لـ NS-one وجسم مضاد ثانوي مقترن بـ Cy3 يظهر باللون الأحمر. كما صُبغت النوى بصبغة DAPI التي تظهر باللون الأزرق. ولاحقاً، عند مرور 22 و40 ساعة بعد الترانسفكشن، فُحص تراكم إنتاج الفيريونات المعدية في السوائل الطافية للمزارع الخلوية للخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي بـ RNA عن طريق مقايسات اللويحات (plaque assays).

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استعادة فيروس معدٍ بالكامل من cDNA مستنسخ لسلالة إيجابية، من الحمض النووي الريبوزي RNA، مثل فيروس التهاب الدماغ الياباني. لذا، لا تنسَ أن العمل مع فيروس التهاب الدماغ الياباني والمسببات المرضية البشرية الأخرى يمكن أن يكون خطيراً للغاية. ومن الضروري الحصول على تدريب مناسب في مجال السلامة البيولوجية قبل تنفيذ هذا الإجراء.