بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنقاذ جزيئات الفيروس المعدية المصنوعة بالكامل من CDNA مستنسخ من خيوط إيجابية ، فيروسات الحمض النووي الريبي التي تكون جينوماتها في نفس قطبية Mr.NA الخلوي ، مثل فيروس التهاب الدماغ الياباني. علم الوراثة الجيني القائم على CNA هو طريقة شبه تخطيطية تتيح التلاعب المباشر بالحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي ، وبالتالي توليد فيروسات مؤتلفة للدراسة الجزيئية والوراثية في تكاثر الفيروس والتسبب في المرض. توفر هذه التقنية أيضا منصة قيمة تسمح بتطوير لقاح محدد وراثيا ونواقل فيروسية لإيصال الجينات الغريبة.

هذه الأوعية قابلة للتطبيق على استنساخ CDNA كامل الطول للطول أو السلالة الإيجابية ، فيروسات الحمض النووي الريبي ، خاصة تلك التي تحتوي على جينومات أكبر من 10 كيلو بايت. سيظهر الإجراء العديد من أعضاء مساعد الباحث المختبري البروفيسور سان نون إلى زميل ما بعد الدكتوراه UNG و Xing y Kim والطلاب الجامعيين ، جوردان فرانك. يغطي جزء الفيديو من هذا المنشور تحضير الكروموسوم الاصطناعي البكتيري الذي يحتوي على التسلسلات ذات الأهمية ، وتوليف الحمض النووي الريبي ، المنسوخ من البلازميد الخلفي ، وكيفية قياس عدوى الحمض النووي الريبي ، وإنتاجية الفيروس.

يتم توفير جميع الإجراءات المستخدمة قبل إنشاء البلازميد الخلفي في بروتوكول النص بتفصيل كبير. لهذا الإجراء ، قم أولا بزراعة مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية DH 10 B ، حاملة البلازميد الخلفي في ثلاثة ملليلتر من مرق XYT مع الكلورامفينيكول. احتضان المزرعة لمدة 10 ساعات عند 35 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 إلى 250 دورة في الدقيقة.

بعد 10 ساعات ، قم بتوسيع نطاق الثقافة ، ثم قم بتلقيح 500 ميكرولتر من النمو إلى 500 مل من الوسط وقم بزراعة اللقاح لمدة ست ساعات مع هز قوي بعد ست ساعات. الطرد المركزي للثقافة البكتيرية في 2 250 مليلتر زجاجات عند 3 ، 100 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق كل بيليه في 30 مل من محلول GTE.

أضف 500 ميكرولتر من الليزوزيم واحتضن المعلقات على الجليد لمدة 10 دقائق. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول تحلل جديد للخطوة التالية. بعد 10 دقائق ، أضف 60 مل من محلول التحلل واخلطه عن طريق التحريك حتى يبدو المحلول صافيا.

دع التفاعلات تذهب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 45 مل من محلول التحييد إلى كل زجاجة واقلب الزجاجات حتى تمتزج جيدا. ثم ضعيها على الجليد لمدة 10 دقائق.

اجمع المحللات المعادلة باستخدام الطرد المركزي المبرد عالي G. ثم اجمع المواد الطافية في زجاجتين جديدتين سعة 250 مل. أضف 0.6 حجم من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ لكل منها وضعها على الثلج لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتدوير الرواسب ، ثم تخلص من المواد الطفية وقم بإذابة الكريات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت TE. اجمع بين المجلدين في أنبوب واحد سعة 50 مليلتر وقم بترسيب الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة حجم متساو من خمسة كلوريد ليثيوم مولي واحتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق. استخدم الطرد المركزي البارد لمدة 20 دقيقة لتجميع راسب الحمض النووي الريبي.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 250 مل. أضف مجلدين من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ وضع الأنبوب على الجليد حتى يتشكل راسب الحمض النووي. بعد 20 دقيقة ، قم بتدوير الراسب ، وشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي في 9.5 مل من المخزن المؤقت TE وانقل محلول الحمض النووي إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

استمر في التحضير عن طريق إعداد تدرج كلوريد السيزيوم باستخدام بروميد الديوم. قم بتحميل الخليط في أنبوب بولي بروبلين قابل للغلق باستخدام حقنة بإبرة قياس 18 وأغلق الأنبوب. قم بتدوير الأنبوب المغلق طوال الليل في جهاز طرد مركزي فائق لتشكيل تدرج كلوريد السيزيوم.

في اليوم التالي ، اجمع شريط الحمض النووي من البلازميد الخلفي من تدرج كلوريد السيزيوم. استخدم إبرة قياس 18 لإنشاء فتحة تهوية في الجزء العلوي من التدرج وإبرة قياس 20 مع حقنة لجمع الحمض النووي الخلفي من جانب التدرج ، ثم نقل المجموعة إلى أنبوب فوج دقيق سعة 1.7 ملليلتر. قم بإجراء الغسيل ، وأضف 2.5 كمية من البيوتانول المشبع بالماء واخلطه مع الدوامة العادية.

ثم الطرد المركزي للخليط في درجة حرارة الغرفة ونقل المرحلة المائية السفلية إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر من الطرد الصغير. كرر هذا الغسيل ست مرات لإزالة كل بروميد الإيثيديوم. الآن عجل الحمض النووي الخلفي.

أضف حجما واحدا عاشرا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار و 2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب. احتضن الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم الطرد المركزي للراسب في درجة حرارة الغرفة وغسل حبيبات الحمض النووي بملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول.

كرر الدوران واجمع الحبيبات مرة أخرى. أخيرا ، قم بتجفيف الحمض النووي المحبب بالهواء لمدة 10 دقائق وقم بتقطيعه في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. ابدأ بهضم إنزيم تقييد واسع النطاق للبلازميد الخلفي باستخدام xbo.

واحد في الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر. قم بإجراء هذا الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 15 ساعة. بعد ذلك ، قم باحتضان عملية الهضم ب 25 وحدة إضافية من نوكلياز فول المونج عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد الحضانة ، ارفع الحجم إلى 300 ميكرولتر بالماء المقطر. الآن قم بإجراء استخراج الفينول عن طريق إضافة حجم متساو من كلوروفورم الفينول ، كحول الأيزواميل إلى العينة المخففة. الدوامة بقوة لمدة دقيقة ، والدوران أسفل الأنبوب ونقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد.

ثم كرر الاستخراج باستخدام الكلوروفورم. بعد ذلك ، استرجع الحمض النووي الخلفي الخطي عن طريق ترسيب الإيثانول. اجمع حبيبات الحمض النووي بالطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بمليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول.

كرر خطوة الطرد المركزي وجفف الحبيبات بالهواء. بعد 10 دقائق من التجفيف ، قم بإذابة حبيبات الحمض النووي في 30 ميكرولتر من الماء المقطر. ثم افحص ميكرولتر واحد من الظهر المستعاد على هلام AROS بنسبة 0.8٪.

بعد ذلك ، قم بإعداد نسخ جريان سطحي سعة 25 ميكرولتر من الحمض النووي الخلفي الخطي ، بما في ذلك UTP المثلث لقياس كمية الحمض النووي الريبي. قم بإجراء التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة. ثم افحص ميكرولتر أو اثنين من تفاعل نسخ الجريان السطحي على هلام AROS 0.6٪.

ابدأ ب BHK 21 خلية تزرع لمدة 24 ساعة في أطباق 150 ملم مطلية بمعدل 3 ملايين خلية لكل طبق. شطف الخلية أحادية الطبقة بمحلول بارد A ثم افصلها عن طريق التربسين. إيزيشن. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 270 GS لمدة دقيقتين.

ثم أعد تعليق الخلايا في 50 مل من المحلول البارد A وقم بتدويرها مرة أخرى. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات بعد آخر غسلة. أعد تعليق الخلايا عند 20 مليون لكل مليلتر في محلول أ ، ثم امزج 400 ميكرولتر من تعليق الخلية مع ميكروغرامين من الحمض النووي الريبي الاصطناعي في فطرة ملليمترين.

قم بتنقية الخليط بالكهرباء على الفور في ظل الظروف المثلى واترك الخلايا ترتاح لمدة 10 دقائق. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب فوج صغير يحتوي على 600 ميكرولتر من وسط الثقافة الكامل. الآن قم بإعداد التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف للخلايا الكهربائية في حجم مليلتر واحد ، لوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف على طبقات أحادية من خلايا bhk 21 الطبيعية بعد أربع إلى ست ساعات من الحضانة ، وتراكب الخلايا بنسبة 0.5٪ aros في MEM بالإضافة إلى FBS وزراعتها لمدة أربعة أيام أخرى.

تم تزويد خلايا Bhk 21 بالكهرباء أو الكهربية باستخدام نسخ الحمض النووي الريبي المشتقة من اثنين من المستنسخة المستقلة من JEV كامل الطول بعد أربعة أيام ، تم تلطيخ الخلايا باللون البنفسجي الكريستالي لعرض الحمض النووي الريبي المعدي في الخلايا. باستخدام هذه البقعة ، تم تحديد المراكز المعدية. بعد ذلك ، تم فحص تعبير البروتين الفيروسي في الخلايا الكهربية للحمض النووي الريبي بعد 20 ساعة من التعدي باستخدام مضاد NS ، ومصل مضاد للأرانب وجسم مضاد ثانوي مترافق ثلاثي SI شوهد باللون الأحمر.

كانت النوى مضادة للبقع مع DAPI التي شوهدت باللون الأزرق. في وقت لاحق بعد 22 و 40 ساعة من التعدي ، تراكم إنتاج المتغيرات المعدية في الثقافة. تم فحص المواد الطرافية للخلايا الكهربائية للحمض النووي الريبي بواسطة فحوصات البلاك.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنقاذ الفيروس المعدي بالكامل من CNA المستنسخ من السلالة الإيجابية ، الحمض النووي الريبي ، مثل فيروس التهاب الدماغ الياباني. لذلك لا تنس أن العمل مع فيروس التهاب الدماغ الياباني ومسببات الأمراض البشرية الأخرى يمكن أن يكون خطيرا للغاية. التدريب المناسب على السلامة البيولوجية ضروري قبل تنفيذ هذا الإجراء.