سريع

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تهجين متسلسل سريع (in situ hybridization) على أنسجة دماغية مثبتة بالبارافورمالدهيد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجفيف مقاطع أنسجة الدماغ ومعالجتها بكواشف المعالجة المسبقة 1 و2 و3. وتتمثل الخطوة الثانية في تهجين المقاطع بمجسات أوليغونوكليوتيد أولية، ثم المجسات الثانية والثالثة والرابعة.

بعد ذلك، يتم إضافة ركيزة fast red للكشف عن الـ RNA المستهدف. وتتمثل الخطوة النهائية في قياس مستوى إشارات mRNA باستخدام برنامج Image J. وفي النهاية، يمكن الحصول على التغيرات في التعبير الجيني للـ RNA من خلال مقارنة المجموعات التجريبية والضابطة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في كونها بسيطة نسبيًا، وغير مكلفة، وقابلة للتكرار، وتستغرق أقل من يومين لإتمامها. تم تطوير هذا العمل من قبلي وبمشاركة John Jay Lenan من Ross University School of Veterinary Medicine و Jean Soza و RU Tao من كلية الطب بجامعة Florida Atlantic University. وفي هذا الإجراء، ولأغراض التجفيف، يتم أخذ أربع شرائح من صناديق شرائح المجهر المحفوظة في مجمد بدرجة حرارة 80- درجة Celsius.

قم بتعيين الأقسام لاختبارات P-P-I-B-D-A-P-B و HT two A genes وقم بتمييزها وتسميتها باستخدام قلم حبر جاف. بعد ذلك، اغمر الشرائح في كحول 100% في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم جفف الشرائح لمدة خمس دقائق في خزانة استخراج الغازات؛ ولإجراء المعالجة المسبقة، اسحب 20 µL من كاشف المعالجة المسبقة الأول لكل قسم، وضع الشرائح على قضيب حامل في صينية ترطيب.

رُج صينية الترطيب بلطف على هزاز أفقي بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين. اغمر الشرائح في دورق سعة 1000 milliliter يحتوي على 450 milliliters من كاشف المعالجة المسبقة الثاني.

بعد ذلك، تُغلى الشرائح لمدة خمس دقائق إجمالاً عند 100 degree Celsius لاستعادة بنية RNA. بعد ذلك، تُغسل الشرائح مرتين بماء مقطر مزدوج لمدة دقيقتين في كل مرة. تُوضع الشرائح في كحول بتركيز 100% لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، جفف الشرائح لمدة خمس دقائق. في خزانة استخراج الغازات، استخدم قلماً كارهاً للماء لرسم دائرة حول المنطقة المحددة في مقطع النسيج. لاحقاً، انقل بواسطة الماصة 10 µL من كاشف المعالجة المسبقة الثالث إلى كل منطقة محددة لزيادة نفاذية المسبار، ثم غطِ صينية الترطيب بغطاء.

بعد ذلك، ضع الصينية في فرن التهجين المجهز بهزاز أفقي. اضبط درجة حرارة الفرن على 40 °C وهز الصينية بلطف لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين باستخدام ماء مقطر مزدوج لمدة دقيقتين في كل مرة. في هذه الخطوة، انقل 10 µL من مسبار P-P-I-B-D-A-P-B أو HTR two A باستخدام الماصة على المناطق المحددة.

ثم قم بتغطية صينية الترطيب بغطاء لمنع تبخر الكاشف. رج الشرائح بلطف باستخدام الرجاج الأفقي بسرعة منخفضة أثناء تحضينها عند 40 °C في الفرن لمدة ساعتين. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين باستخدام محلول الغسيل المنظم لمدة دقيقتين في كل مرة، ثم انقل 10 µL من كاشف التضخيم الأول إلى كل منطقة محددة.

رُجَّ الشرائح وحضنها عند 40 degrees Celsius لمدة 30 minutes. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين باستخدام محلول الغسيل المنظم لمدة دقيقتين في كل مرة، ثم انقل 10 µL من كاشف التضخيم الثاني على كل منطقة محددة. رُجَّ الشرائح وحضنها عند 40 degrees Celsius لمدة 15 minutes.

بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين باستخدام محلول الغسيل لمدة دقيقتين. وفي كل مرة، انقُل 10 µL من كاشف التضخيم الثالث إلى كل منطقة محددة. رجّ الشرائح ثم حضنها عند درجة حرارة 40 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، تُغسل الشرائح مرتين باستخدام محلول الغسيل لمدة دقيقتين. يتم سحب 10 µL من كاشف التضخيم الرابع باستخدام الماصة ووضعها على كل منطقة محددة. تُرج الشرائح ثم تُحضن عند 40 °C لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين باستخدام محلول الغسيل لمدة دقيقتين. انقل 10 µL من كاشف التضخيم الخامس باستخدام الماصة على كل منطقة محددة. رج الشرائح ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين باستخدام محلول الغسيل لمدة دقيقتين. باستخدام الماصة، ضع 10 µL من كاشف التضخيم السادس على كل منطقة محددة. رج الشرائح ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، تُغسل الشرائح مرة أخرى مرتين باستخدام محلول الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة. الآن، تُنقل 10 µL من الكاشف الأحمر إلى كل منطقة محددة، وتُوضع الشرائح في حوض الرطوبة على الهزاز الأفقي في درجة حرارة الغرفة، وتُرج برفق وبسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. ثم تُغسل الشرائح مرتين باستخدام ماء مقطر مزدوج لمدة 10 دقائق.

في كل مرة، يتم تجفيف الشرائح في الفرن عند 60 degrees Celsius لمدة 15 minutes. بعد ذلك، توضع الشرائح في xylene داخل خزانة استرداد الغازات لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم سحب 20 µL من وسط تثبيت قائم على xylene باستخدام الماصة ووضعه على كل منطقة مختارة، ثم تغطيتها بغطاء شريحة.

في هذه الخطوة، قم بسحب وإفلات ملف الصورة في نافذة الصورة الرئيسية J. انتقل إلى شريط القائمة واختر image. بعد ذلك، اختر type من القائمة المنسدلة ثم حدد eight bit.

بعد ذلك، اختر adjust ثم حدد threshold لفتح مربع الحوار. قم بتعديل قيمة الشريط السفلي في مربع الحوار بحيث يتم إزالة الخلفية غير المرغوب فيها. انتقل إلى شريط القائمة واختر Analyze، ثم حدد analyze particles لفتح مربع حوار ثانٍ.

اضبط حجم الجسيمات على 10. بعد ذلك، اختر إظهار المخططات التفصيلية (show outlines)، ثم اختر عرض النتائج وتلخيص المربعات (display results and summarize boxes). وأخيراً، انقر فوق موافق لعرض بيانات الجسيمات في مربعات الحوار.

لإجراء الحسابات عبر جداول البيانات، أدخل البيانات في ورقة Excel واحسب متوسط عدد الجسيمات في مجموعة المحلول الملحي ليكون بمثابة خط أساس. ثم احسب النسبة المئوية لكل قسم وأنشئ رسماً بيانياً بناءً على ذلك. فيما يلي مناظر مجهرية ضوئية لإشارات التهجين المحددة بالنقاط الحمراء.

تم تثبيت الأنسجة باستخدام بارافورمالدهيد في جرذان خُدرت بعمق وكانت قد عولجت مسبقاً بمحلول ملحي وMDMA. المسابر قليلة النوكليوتيد المستخدمة هي D-A-P-B-P-P-I-B وHT two A. يوضح هذا الشكل التأثير على التعبير الجيني لـ HT two A في منطقة تحت المهاد لدى الجرذان التي عولجت مسبقاً بـ MDMA، حيث لوحظ انخفاض بنسبة 20% في التعبير عن HT two, a. تسهل هذه التقنية على الباحثين في مجال العلوم العصبية قياس التعبير الجيني لـ messenger R a، باستخدام التهجين الموضعي (in situ hybridization) على أنسجة الدماغ المثبتة بالبارافورمالدهيد.