سريع في الموقع التهجين باستخدام قليل النوكليوتيد تحقيقات على مسبوقة لامتصاص العرق دماغ الفئران مع السيروتونين متلازمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تهجين سريع في C two على أنسجة المخ البادئة الألدهيد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجفيف أقسام أنسجة المخ أولا ومعالجة الأقسام بالمعالجة المسبقة من الكواشف الأولى والثانية والثلاثة. الخطوة الثانية هي تهجين الأقسام باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الأولية ثم المجسات الثانية والثالثة والرابعة.

بعد ذلك ، أضف ركيزة حمراء سريعة للكشف عن الحمض النووي الريبي المستهدف. الخطوة الأخيرة هي تحديد مستوى إشارات mRNA باستخدام برنامج Image J. في النهاية ، يمكن الحصول على التغييرات في التعبير الجيني للحمض النووي الريبي من خلال مقارنة المجموعات التجريبية والضابطة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها بسيطة نسبيا وغير مكلفة قابلة للتكرار وتستغرق أقل من يومين لإكمالها. تم تطوير هذا العمل وجون جاي لينان من كلية الطب البيطري بجامعة روس وجان سوزا ورو تاو من كلية الطب بجامعة فلوريدا أتلانتيك. في هذا الإجراء ، يأخذ الجفاف أربع شرائح من صناديق شرائح المجهر المخزنة في الفريزر سالب 80 درجة مئوية.

قم بتعيين الأقسام لاختبارات P-P-I-B-D-A-P-B و HT اثنين من الجينات A وقم بتسميتها بقلم حبر جاف. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في كحول بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم جفف الشرائح لمدة خمس دقائق في غطاء الدخان لماصة المعالجة المسبقة 20 ميكرولتر من المعالجة المسبقة كاشف واحد لكل قسم ، ضع الشرائح على سكة رف في صينية رطوبة.

رج صينية الترطيب برفق على شاكر أفقي بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين. اغمر الشرائح في دورق 1000 مل يحتوي على 450 مل من كاشف المعالجة المسبقة.

بعد ذلك ، قم بغلي الشرائح لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية لاستعادة بنية الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين في كل مرة. ضع الشرائح في كحول 100٪ لمدة خمس دقائق.

ثم جفف الشرائح لمدة خمس دقائق. في غطاء الدخان ، استخدم قلما كارها للماء لرسم دائرة حول المنطقة المحددة في قسم الأنسجة. بعد ذلك ، قم بتوصيل 10 ميكرولترات من المعالجة المسبقة بثلاثة كاشف إلى كل منطقة محددة لزيادة تغلغل المسبار وتغطية صينية الرطوبة بغطاء.

بعد ذلك ، ضع الصينية في فرن التهجين المجهز بشاكر أفقي. اضبطي درجة حرارة الفرن على 40 درجة مئوية ورجي الصينية برفق لمدة 30 دقيقة بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين في كل مرة. في هذه الخطوة، قم بتعبئة 10 ميكرولتر من مسبار P-P-I-B-D-A-P-B أو HTR two A في المناطق المحددة.

ثم قم بتغطية صينية الرطوبة بغطاء لمنع تبخر الكاشف. رج الشرائح برفق على الخلاط الأفقي بسرعة منخفضة أثناء احتضانها على حرارة 40 درجة مئوية في الفرن لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة ، ماصة 10 ميكرولترات من كاشف التضخيم في كل منطقة محددة.

رج الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن الغسيل المؤقت لمدة دقيقتين في كل مرة ، قم بتعبئة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين. في كل مرة ، قم بعمل ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم الثلاثة في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين. ماصة 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم الأربعة في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين. Pipet 10 ميكرولتر من كاشف التضخيم الخمسة في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين. Pipet 10 ميكرولتر من ستة كاشف تضخيم في كل منطقة محددة. رج الشرائح واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

ثم اغسل الشرائح مرة أخرى مرتين باستخدام عازلة الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة. الآن قم بنقل 10 ميكرولترات من الكاشف الأحمر إلى كل منطقة محددة، ضع الشرائح في درج الرطوبة على الخلاط الأفقي في درجة حرارة الغرفة ورجها برفق بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الشرائح مرتين بالماء المقطر المزدوج لمدة 10 دقائق.

في كل مرة ، جفف الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية في الفرن لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الشرائح في الزيلين في غطاء الدخان لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتعبئة 20 ميكرولترا من وسائط التثبيت القائمة على الزيلين على كل منطقة محددة وقم بتغطيتها بزلة غطاء.

في هذه الخطوة ، قم بسحب ملف الصورة وإفلاته في نافذة الصورة الرئيسية J. انتقل إلى شريط القائمة وحدد الصورة. بعد ذلك ، حدد النوع من القائمة المنسدلة وحدد ثمانية بت.

بعد ذلك ، حدد ضبط ثم حدد عتبة لفتح مربع الحوار. اضبط قيمة الشريط السفلي في مربع الحوار بحيث تتم إزالة الخلفية غير المرغوب فيها. انتقل إلى شريط القائمة وحدد تحليل، ثم حدد تحليل الجسيمات لفتح مربع حوار ثان.

اضبط حجم الجسيمات على 10. بعد ذلك، حدد إظهار المخططات التفصيلية وحدد مربعات عرض النتائج والتلخيص. أخيرا ، انقر فوق موافق لعرض بيانات الجسيمات في مربعات الحوار.

لحساب جدول البيانات، أدخل البيانات في ورقة Excel وقم بحساب متوسط عدد الجسيمات في مجموعة المحلول الملحي كخط أساس. ثم احسب مستوى النسبة المئوية لكل قسم وقم بعمل رسم بياني وفقا لذلك. فيما يلي المناظر المجهرية الضوئية لإشارات التهجين المشار إليها بالنقاط الحمراء.

كانت الأنسجة مسبوقة بألدهيد بارافورم في الفئران المخدر بعمق والتي سبق معالجتها بالمحلول الملحي و MDMA. مجسات قليل النوكليوتيدات المستخدمة هي D-A-P-B-P-I-B ، و HT two A.يوضح هذا الشكل التأثير على التعبير الجيني HT two A تحت المهاد في الفئران التي عولجت سابقا ب MDMA وانخفاض بنسبة 20٪ في HT two ، لوحظ تعبير. تسهل هذه التقنية على الباحثين في مجال علم الأعصاب قياس التعبير الجيني للرسول R a ، باستخدام التحديد في الموقع على الطفيلي ، وهو نسيج المخ المسبوق بالارتفاع.