رسم الخرائط البصرية البينية العضلية شبكية كاليفورنيا 2+ وإمكانية الغشاء في قلب الأرنب Langendorff perfused-
سبتمبر 10, 2015
توضح هذه المقالة بروتوكول مفصلة والمعدات اللازمة لرسم الخرائط الضوئية المزدوجة من الغشاء المحتملين (V م) وخالية شبكية داخل الهيولى العضلية (SR) كا 2+ في قلب الأرنب Langendorff perfused. وتسمح هذه الطريقة للمراقبة المباشرة والكمي لV م وريال كا 2+ ديناميكية في قلب سليمة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خريطة بصرية في نفس الوقت للشبكة الحرة داخل الساركوبلازمة والكالسيوم وإمكانات الغشاء في قلب الأرنب المعزول LOR السليم. يتم تحقيق ذلك عن طريق استئصال قلب الأرنب أولا وقنية الشريان الأورطي من أجل نضح اللانر الرجعي. الخطوة الثانية هي القضاء على الانكماش عن طريق إضافة انكماش الإثارة الذي ينفصل عن البرفو الثمانية.
بعد ذلك ، يتم تحويل التروية إلى حلقة إعادة تدوير صغيرة الحجم ويضاف مؤشر الكالسيوم منخفض التقارب في درجة حرارة الغرفة. تتمثل الخطوات النهائية في تسخين القلب إلى 37 درجة مئوية باستخدام حلقة وفرة الحجم الكبير وإضافة الصبغة الحساسة للجهد. وهكذا ، أثناء التجربة ، يتم قياس التغيرات في الكالسيوم وإمكانات الغشاء عن طريق إثارة القلب بالضوء الأزرق وقياس الضوء المنبعث بكاميرات CM OS عالية السرعة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها تسمح للمحققين بفحص الشبكة الساركوبلازمية مباشرة أو SR لديناميكيات الكالسيوم القصيرة دون تدخل من إشارات الكالسيوم عبر الغشاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة أيضا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بدور معالجة الكالسيوم SR في المساهمة في عدم انتظام ضربات القلب ، لأن إمكانات الغشاء يتم تسجيلها في وقت واحد مع الكالسيوم SR ، بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن إشارات الكالسيوم الضوئية SR ذات سعة منخفضة جدا. لذلك ، يعد التحميل المناسب لمؤشر الكالسيوم أمرا ضروريا لهذا البروتوكول ، من الضروري أن يكون لديك محلول تايرو طازج في متناول اليد.
أربعة لترات تكفي. لا تخلط محاليل المرق المركزة دون تخفيف. قم أيضا بإعداد الحلول الأخرى مسبقا وفقا لتوجيهات بروتوكول النص ، وقم بتزويد التيروس بنسبة 95٪ من الأكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، واضبط تدفق الغاز لضبط درجة الحموضة في المحلول بالقرب من 7.4.
يجب أن يكون المحلول في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد نظام التروية L andorf المعاد تدويره عن طريق وضع مرشح نايلون مضمن بمسام 11 ميكرون لتصفية شبات البيرفو. الآن قم بتجهيز نظام الوفرة الرئيسي بحوالي لترين من التيروس المؤكسج.
يشمل الحجم الإجمالي لترين المحلول في الخزان. بعد ذلك ، قم بإعداد وتجهيز خط وفرة قصير يتجاوز خزان المحلول من أجل إنشاء حلقة وفرة صغيرة الحجم لإعادة تدوير الأنفلونزا أوه خمسة نيوتن صباحا. يجب أن يكون تنزيل الحجم الإجمالي في نظام إعادة التدوير الأصغر حوالي 150 ملليلترا.
لإعداد نظام مراقبة الضغط ، قم بتوصيل محول الضغط بخط الوفرة وقم بتوصيل خرج محول الطاقة بمكبر للصوت عبر الجسر. الآن قم بتشغيل نظام الحصول على البيانات. اضبطه لمراقبة مخطط كهربية القلب وضغط الوفرة باستمرار.
بعد ذلك ، اضبط ضغط التروية الأساسي إلى صفر ملليمتر من الزئبق. أخيرا ، قم بمحاذاة كاميرا رسم الخرائط البصرية كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء ، قم بتأمين الأرنب وتخديره باستخدام البنتوباربيتال ، جنبا إلى جنب مع بلعة 1000 وحدة من الهيبارين.
غطي العينين لتهدئة الأرنب. ابدأ بشق خط الوسط لكشف القص والأضلاع باستخدام مقص طرف حاد. قطع من خلال القص بين الخنجري والميبوم.
بعد ذلك ، افتح القص بعناية دون الإضرار بالقلب وانشر الأضلاع لكشف القلب. ثم قم بإزالة كتلة رئة القلب بالكامل بسرعة عن طريق قطع جميع الأوعية والأنسجة المحيطة. انقل كتلة رئة القلب إلى حوالي 100 مل من محلول تيرو المثلج.
في كتلة الأنسجة المستأصلة ، حدد موقع الشريان الأورطي وقطع الشريان الأورطي الصاعد بالقرب من الفروع الثلاثة للقوس الأبهري. ثم قم بتقشير الشريان الأورطي باستخدام قنية قياس ثمانية متصلة بنظام الوفرة. قم بتثبيت الشريان الأورطي في القنية بقطعة من خياطة الحرير الصفرية USP.
بعد تأمين القنية ، قم بتشريح القصبة الهوائية والرئتين والدهون النخابية بعناية. بعد ذلك ، حدد الصمام التاجي واستخدم ملقطا حادا ومقصا بعناية لإتلاف أو إزالة نشرة واحدة. وبالتالي ، لا يمكن أن يحدث احتقان المحلول في البطين الأيسر.
استمر بغمر القلب في حجرة التروية أفقيا مع الجانب الأمامي لأعلى. ضع القنية على قطعة من القشر. قم بتأمين القنية بدبابيس على شكل حرف U يتم إدخالها من خلال قطعة السرد وفي قاع السيليكون من طبق التروية.
هذا سيمنع القلب من الحركة. أثناء التصوير ، يمكن استخدام دبوس حشرات صغير لتثبيت القمة إذا لزم الأمر ، وقياس كمية محلول التايرو المستخدم أثناء التقنية واستبداله بمحلول جديد للحفاظ على إجمالي محلول الدوران عند لترين. الآن اغمر أقطاب تخطيط القلب بالكامل في الحمام على جانبي القلب، ولكن ليس على اتصال بالقلب.
ثم تحقق من أن هذا يجعل الرصاص العادي مورفولوجيا تخطيط القلب. وفي الوقت نفسه ، حافظ على ضغط الأبهر عند 60 إلى 70 ملم من الزئبق عن طريق ضبط تدفق النفهات بين 25 و 35 مليلتر في الدقيقة. الآن ، أطفئ أضواء الغرفة وأضف 0.3 إلى 0.6 مل من محلول مخزون الستاتين BLEs إلى PERFU ثمانية للحصول على تركيز نهائي من 10 إلى 20 ميكرومولار.
بعد 10 إلى 15 دقيقة ، يجب أن تتوقف تقلصات القلب. ثم انتقل إلى نظام وفرة الحجم الصغير. أحد مفاتيح تصوير الكالسيوم SR الناجح هو التحميل المناسب لصبغة التدفق خمسة نيوتن أم.
يتطلب ذلك نضحا صغيرا لتحقيق تركيز عال للصبغة وظروف درجة حرارة الغرفة. لتجنب الأسترة D من D في العصارة الخلوية ، قم الآن بإعداد 500 ميكرولتر من محلول تحميل الأنفلونزا O خمسة N صباحا واخلطه مع 500 ميكرولتر من محلول الطريق. ثم أضفه إلى PERFU الثمانية.
اترك التنزيل يستمر لمدة 45 دقيقة ثم قم بتشغيل الحمام المائي المتداول لتسخين النظام إلى 37 درجة مئوية. بعد ساعة من التنزيل ، ارجع إلى الحجم الأكبر ل Perfu eight. بعد ذلك ، امزج 50 ميكرولترا من الصبغة الحساسة للجهد RH 2 37 في مليلتر من التيروس الدافئ.
قمبحقن هذا ببطء في النظام على مدى خمس دقائق تقريبا وتابع رسم الخرائط البصرية للقلب. للبدء ، ركز كاميرات رسم الخرائط البصرية على المجال المناسب لتقليل الحركة على سطح PERFU الثماني. تطفو زلة غطاء على المحلول.
الآن اضبط شعاع LED للضوء لتوفير إضاءة موحدة للقلب. لكل تسجيل بصري، اضبط بروتوكول السرعة المطلوب. قم بتشغيل ضوء الإثارة واجمع ثانية إلى أربع ثوان من البيانات في غضون ساعة إلى ساعتين.
الضوضاء الناتجة عن الصبغة المسربة ستضع حدا للتجربة. ثم اغسل النظام بالماء منزوع الأيونات. ثم 70٪ إيثانول وانتهي بشطف آخر من الماء منزوع الأيونات.
باستخدام البروتوكول الموصوف ، يمكن فصل الفصل الطيفي لإشارة الجهد عبر الغشاء والشبكة الساركوبلازمية أو إشارة الكالسيوم SR. كما تم تسجيل آثار بصرية أثناء السرعة المستمرة. ثم تم إنشاء خرائط التنشيط من البيانات عن طريق رسم وقت التنشيط لكل بكسل.
على الرسم البياني المتساوي الزمن ، هناك تأخير نموذجي من ثمانية إلى 10 مللي ثانية بين الإشارتين. كان من الممكن تحديد التغيير النسبي في SR الانبساطي. حمل الكالسيوم وسعات إطلاق الكالسيوم الانقباضي SR في دورات سرعة مختلفة. لوحظ التعامل المرضي مع الكالسيوم SR بعد تطبيق ناهض مستقبلات بيتا الأدرينالية إيزوبروتيرينول.
تشير الأسهم الحمراء إلى تسرب واضح للكالسيوم من الأب. في ظل هذه الظروف ، يمكن أن يحدث تحفيز إمكانات الفعل بوساطة الكالسيوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء رسم خرائط بصرية متزامنة لإمكانات الغشاء وإشارات الكالسيوم SR في قلب الأرنب السليم Lang Endorf
.اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تصف هذه المقالة بروتوكولاً لرسم تخطيطي مزدوج للبصريات لإمكانية الغشاء العابرة والكالسيوم الحر داخل الشبكة الإندوبلازمية في قلب الأرنب المصبوغ بطريقة Langendorff. تمكن هذه الطريقة من الملاحظة المباشرة وقياس هذه الديناميكيات في القلب السليم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- فيزيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- تقنيات التصوير البصري
الخلفية
- فهم الديناميكيات القلبية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظيفة القلب.
- تعتبر إمكانيات الغشاء العابرة ومستويات الكالسيوم من المؤشرات الرئيسية لصحة القلب.
- يوفر التخطيط البصري طريقة غير جراحية لدراسة هذه المعلمات.
- تتيح تقنية Langendorff-perfusion إجراء دراسات على القلب المعزول.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لرسم تخطيطي بصري متزامن لـ V m و SR Ca 2+.
- لتعزيز فهم الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية.
- لتوفير بروتوكول مفصل للباحثين في المجال.
الطرق المستخدمة
- استئصال قلب الأرنب وقسطرة الأبهر للتسريب الرجعي.
- استخدام عامل غير مقترن للإثارة والتعاقد لمنع التقلص.
- التحول إلى حلقة تسريب دائرية ذات تقارب منخفض لمؤشر الكالسيوم.
- تسخين القلب وإضافة صبغة حساسة للجهد لرسم الخرائط البصرية.
النتائج الرئيسية
- قياس متزامن ناجح لـ V m وديناميكات SR Ca 2+.
- تبين فعالية تقنية التخطيط البصري.
- قدمت رؤى حول العلاقة بين الكالسيوم وإمكانية الغشاء العابرة.
- أنشأت بروتوكولًا موثوقًا للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- تقنية التخطيط البصري المزدوج فعالة لدراسة الديناميكيات القلبية.
- يمكن لهذه الطريقة أن تتقدم بالبحوث في فسيولوجيا القلب.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية دراسات على أمراض القلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables direct, simultaneous measurement of intra-sarcoplasmic reticulum calcium and transmembrane potential in intact cardiac tissue, providing mechanistic insight into excitation-contraction coupling and arrhythmogenic substrates. By resolving spatial and temporal dynamics of SR Ca2+ handling in a physiologically relevant model, it supports target validation and de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges molecular mechanisms with tissue-level phenotypes, enhancing predictive confidence in preclinical safety and efficacy assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying SR Ca2+ load and release dynamics under pathophysiological stress, such as beta-adrenergic stimulation.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in calcium handling, reducing mechanistic ambiguity in early target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with dual-readout capability for assessing compound effects on both electrophysiology and calcium homeostasis.
- Operational Value: Supports assay standardization through simultaneous Vm and SR Ca2+ monitoring, improving reproducibility in ion channel and calcium modulator screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links molecular perturbations to tissue-level arrhythmogenic phenotypes, enabling disease-relevant system modeling for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying pro-arrhythmic signals early in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical safety profiling, particularly for compounds affecting cardiac ion channels or calcium regulatory proteins.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing bidirectional relationships between Vm and SR Ca2+ under pacing and pharmacological challenge.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs that allow comparison of test compounds against control conditions in a standardized format.
- Analytics: Provides high-resolution spatiotemporal measurements of calcium transients and action potential dynamics, enabling comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Connects findings to preclinical continuity by modeling arrhythmogenic substrates observed in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety pharmacology and mechanism-of-action studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of SR Ca2+ handling and its electrophysiological consequences.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via dual-parameter optical mapping in a controlled Langendorff-perfused system.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by detecting calcium-mediated arrhythmogenic triggers before costly late-stage failures.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on SR calcium stability and transmembrane stability.
Implementation Considerations
- Expertise in optical mapping, perfusion techniques, and fluorescent dye handling is required for successful signal acquisition.
- Instrumentation includes high-speed CMOS cameras, LED excitation systems, and perfusion setups capable of recirculating and large-volume modes.
- Cross-team standardization depends on consistent dye loading, temperature control, and pacing protocols across laboratories.
- Adaptation to other model systems (e.g., rat, human tissue) may require optimization of indicator concentration and perfusion parameters.
- Practical limitations include low signal amplitude of SR calcium indicators, necessitating careful dye loading and minimization of cytosolic interference.
