الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم

ويصف هذه المخطوطة طريقة لقياس تراكم خلية ورم في الرئتين في نموذج حيوان من ورم خبيث.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الورم حول الآليات الجزيئية للانبثاث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تجنيد الخلايا السرطانية داخل عضو بعيد يمكن أن يكون كمية. ابدأ باستخدام كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية لإزالة سرطان الرئة لويس الذي يعبر عن البروتين الفلوري، أو LLC، من حاوية ثقافتها وفقًا للبروتوكولات القياسية.

نقل محلول الخلية الناتجة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر قبل الطرد المركزي، وغسل الطرد المركزي الكريات مرتين في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلايا المسام 40 ميكرومتر، وتمييع التعليق إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر تركيز. ثم تحميل الخلايا في حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة قياس 29، وحقن 100 ميكرولتر من الخلايا في الوريد الذيل لكل ثمانية إلى 10 أسابيع، C57-Black-6، فأر ذكر.

عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم المقص لإزالة الجلد من السطح البطني لكل فأر، وقطع الأضلاع والحجاب الحاجز لفضح التجويف الصدري. استخدم إبرة ضخ مجنحة من عيار 25 والأنابيب لطرد 15 ملليلتر من PBS عبر البطين الأيمن ، وإزالة القلب والزعتر. تجتاح القصبة الهوائية مع ملقط، وسحب ما يصل، تشريح الأنسجة الضامة حول القصبة الهوائية، لحصاد الرئتين.

ثم غسل الرئتين في برنامج تلفزيوني، وفصل فص واحد للتصور من الخلايا الفلورية في الموقع تحت المجهر الفلوري. لهضم أنسجة الرئة، النرد الأول الفص السد مع مقص، ووضع قطع الرئة في حقنة 10 ملليلتر. إغلاق حقنة مع المكبس، ويؤترمس خمسة ملليلتر من حل الهضم في حقنة، وتحريك المكبس داخل وخارج رمح حقنة حتى يتم نشر أنسجة الرئة في جميع أنحاء الحل.

الاستغناء عن الطين الرئة في أنبوب 50 ملليلتر، وهضم الأنسجة على شاكر المتبادل لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بتثفير الأنسجة المتبقية حتى يتم تشتيت خلايا الرئة تمامًا ، وإعادة الأنبوب إلى الشاكر لمدة 30 دقيقة إضافية. ثم تصفية الخلايا من خلال مصفاة المسام 40 ميكرومتر، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

لتحليل خلايا الرئة المعزولة عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة ، قم بإعادة تعليق بيليه في مليلترين من عازل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم الطرد المركزي بيليه مرتين في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد تكملها 1٪ البوم الدم البقري في غسل. بعد الطرد المركزي الثاني، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى BSA، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة المسام 40 ميكرومتر جديدة لتكميم الخلايا السرطانية عن طريق تدفق الخلايا.

تقدم الرئتين العديد من الخلايا GFP-LLC بعد ساعتين من الحقن، مع اختفاء الغالبية العظمى من الخلايا من الرئتين في غضون 24 ساعة. لاحظ أنه يجب استبعاد أي بقع فلورية تم اكتشافها داخل عامل التصفية الأحمر من عدد الخلايا. لتأكيد عدد من GFP ذ م م في الرئتين، واحدة من الفصوص يمكن استخدامها لتحليل تدفق cytometric كما ثبت.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن إجراء القسم المجمد هو طريقة أكثر دقة لمراقبة الموقع الدقيق للخلايا السرطانية.