جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان باستخدام الخلايا الكيراتينية المشتقة من الشعر. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الشعر أولا عن المتبرع. الخطوة الثانية هي إزالة الشعر من أجل تسهيل نمو الخلايا الكيراتينية.

بعد ذلك ، يتم الحفاظ على الخلايا الكيراتينية وتوسيعها في المختبر. الخطوة الأخيرة هي إعادة برمجة الخلايا الكيراتينية إلى خلايا جذعية متعددة القدرات يسببها الإنسان باستخدام طريقة إعادة البرمجة العرضية. في النهاية ، يمكن عزل خلايا IPS البشرية وتوصيفها باستخدام الكيمياء المناعية لإظهار التعبير عن العلامات متعددة القدرات.

الميزة الإجمالية لهذه الطريقة على الطرق الحالية مثل الطريقة الفيروسية القهقرية أو الفيروسية العدسية ، هي أنه باستخدام العامل العرضي ، فإننا نتجنب الجينات المعدلة غير المرغوب فيها. الاندماج في الجينوم في الخلايا الجذعية التي يتم إنشاؤها ابدأ بإذابة قارورة من محلول المصفوفة خارج الخلية على الجليد بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استخدم أطراف الماصة المبردة مسبقا لإضافة 200 ميكرولتر من المحلول إلى 12 مل من وسط DM F 12 المبرد.

أضف ملليلترا واحدا من محلول المصفوفة خارج الخلية المخفف إلى كل بئر من 12. قم بوضع صفيحة جيدة واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية لتغطية الآبار بالمصفوفة. بعد ذلك ، اجمع الشعر البشري الأساسي من رأس المتبرع عن طريق وضع أصابعه بالقرب من جذر الشعر ونتف الشعر بحركة واحدة سريعة وسلسة.

تحقق للتأكد من أن كل شعرة مجمعة تحتوي على بصيلات شعر سليمة. ضع المسام تحت مجهر تشريح وحدد مرحلة نمو كل شعرة. اجمع خمسة إلى 10 شعيرات مستضد من كل فرد لاستخراج الثلج الكيراتيني.

تحتوي مرحلة المستضد ، على عكس المرحلة التائية ، على طبقات متعددة من الظهارة. ضعي عينات الشعر في طبق بتري يحتوي على 10 مل من خليط المضادات الحيوية لمدة خمس دقائق ، ثم اغسليها في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أمسك الشعر بالملقط المعقم واستخدم زوجا من المقصات المعقمة لقطع جذع الشعرة الزائد ، تاركا جزءا من الشعر مع بصيلات شعر سليمة وحوالي 0.5 إلى سنتيمتر واحد من جذع الشعرة.

انقل قطعة شعر واحدة بعناية إلى كل بئر من الصفيحة المطلية بالمصفوفة خارج الخلية. باستخدام الملقط المعقم ، أقوم بتنظيف ما يقرب من 100 إلى 200 ميكرولتر من استبدال المصل. متوسط بالتنقيط لكل بئر يحتوي على عينات من الشعر.

ثم ضع اللوحة في الحاضنة واترك البصيلات تلتصق طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي. أضيفي برفق 100 إلى 200 ميكرولتر أخرى من بديل المصل ، متوسطة بالتنقيط للحفاظ على رطوبة عينات الشعر. افحص عينات الشعر يوميا للتأكد من أن بصيلات الشعر قد تلتصق بنجاح باللوحة.

بمجرد توصيلها ، أضف برفق 500 ميكرولتر إضافي من الوسط إلى البئر. قم بتغيير الوسائط كل يومين. Preco لوحة بستة جدران مع الكولاجين.

اكتب واحدا باستخدام معالجة مسبقة مثل مجموعة مصفوفة الطلاء عند 680 ميكرولتر من وسط التخفيف من المجموعة إلى كل بئر متبوعا ب 6.8 ميكرولتر من محلول مصفوفة الطلاء. رج الطبق برفق لضمان طلاء موحد. اترك الصفيحة المطلية تحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل طلاء الخلايا الكيراتينية.

قم بإزالة محلول الطلاء ، وفصل الخلايا الكيراتينية في الثقافة إلى معلق خلية واحدة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل بئر واحتضان الألواح لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بمجرد تحرير الخلايا من اللوحة ، قم بتعطيل التربسين ب 500 ميكرولتر من المصل المحتوي على وسط وجمع الخلايا في أنبوب معقم سعة 15 مل. قم بإزالة جزء الشعر باستخدام ملقط معقم ، وحبيبات الخلايا ثم إعادة الضغط.

قم بتعليقها في صفيحة متوسطة لنمو الخلايا الكيراتينية الطازجة 40،000 من الخلايا الكيراتينية في بئر واحد من الصفيحة المطلية بالكولاجين في وجود وسط الخلايا الكيراتينية. قم بتغيير الوسائط كل يوم وقم بتمرير الخلايا عندما تكون الثقافة حوالي 80٪ من التقاء V كود لوحة ستة جدران مع الجيلاتين عن طريق إضافة ملليلترين من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى كل منها ، والسماح جيدا للجيلاتين بالتغطية لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك ، قم بفصل الخلايا الكيراتينية التي تمر ستة أو أقل إلى معلق خلية واحدة عن طريق إضافة مليلتر واحد من 0.25٪ tryin لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.

عند 37 درجة مئوية ، قم بتعطيل التربسين بمليلتر واحد من الوسائط التي تحتوي على المصل وجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلترا. حبيبات الخلايا وإعادة تعليقها في وسط الخلايا الكيراتينية. ثم لوحة 100,000 إلى 150,000 الخلايا الكيراتينية لكل بئر في صفيحة من ستة آبار جيلاتينية واحتضانها بين عشية وضحاها في اليوم التالي, اليوم صفر, تحقق من اللوحة للتأكد من أن الخلايا ملتقية من 50 إلى 60٪.

قم بإجراء تعداء لنواقل إعادة البرمجة العرضية على الخلايا الكيراتينية باستخدام نسبة ثمانية ميكرولترات من كاشف التعدي إلى ميكروغرامين من إجمالي الحمض النووي للبلازما كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. في اليوم التالي ، اليوم الأول ، قم بتغيير وسط الخلايا الكيراتينية وتحقق من كفاءة التعدي عن طريق تقدير النسبة المئوية للخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري الأخضر تحت المجهر الفلوري. من المتوقع أن تتراوح كفاءة التعداء من 60 إلى 70٪ في اليوم الثاني.

كرر التعداء لزيادة كفاءة التعداء إلى أكثر من 90٪ ثم قم بترميز طبق 10 سم مسبقا بخمسة ملليلتر من الجيلاتين 0.1٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. لوحة 4 ملايين خلية تغذية معطلة انقسامية لكل طبق 10 سم في وسط FBS كما هو موضح في كونراد آل الكل والسماح للخلايا بالاستقرار والالتصاق طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم الثالث. احصد الخلايا الكيراتينية المنقولة كما هو موضح سابقا ، وأعد تعليقها في صفيحة متوسطة KSR.

90٪ من الخلايا الكيراتينية من أحد الآبار في طبق 10 سم محضر بخلايا مغذية وتغطيتها ب KSR. متوسط: عزل مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان عن طريق التشريح اليدوي من اليوم 21 فصاعدا. تجنب المستعمرات التي تتجمع معا بشكل وثيق واختر فقط المستعمرات المنفصلة بوضوح عن غيرها.

للتشريح اليدوي ، استخدم إبرة قياس 26 لتقطيع المستعمرات إلى قطع صغيرة يبلغ طولها حوالي 300 إلى 600 ميكرومتر تحت مجهر تشريح. انقل القطع من مستعمرة واحدة إلى لوحة تغذية MEF جديدة لإنشاء خط نسيلي من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة على الإنسان. بمجرد أن تصل الثقافة إلى 70 إلى 80٪ من الطلاقة مع مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان والتي يبلغ قطرها حوالي 1.5 ملم ، تستخدم الخلايا طرق التعبئة الأنزيمية القياسية مثل Accutane أو sase أو الكولاجيناز.

أربعة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عند اتباع هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة نتوءات الاسترداد في وقت مبكر يصل إلى ثلاثة أيام بعد تعلق الشعر وستستمر في التكاثر. تم تمرير الخلايا الكيراتينية الموضحة هنا على صفيحة جديدة ويمكن الحفاظ على هذه الخلايا لممرات متعددة.

تظهر هذه الصورة مستعمرة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الخلايا الكيراتينية النموذجية. بعد 32 يوما من إعادة البرمجة ، يمكن أن يحدث بعض التمايز في مركز مستعمرة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. بمجرد انتقاء الخلايا المشتقة يدويا ، عادة ما تعرض نسبة عالية من النواة إلى السيتوبلازمية وحدود مستعمرة محددة.

كما أنها تعبر عن عدد من العلامات متعددة القدرات مثل OCT four nag و TRA one 60. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج الخلايا الكيراتينية من الشعر وإعادة برمجتها إلى خلايا جذعية مزعومة يسببها الإنسان.