تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

الهدف العام من التجربة التالية هو إيصال الجزيئات الكبيرة إلى الخلايا الحية باستخدام dimer، fluorescent tat أو df tat، وهو كاشف يمكنه اختراق الخلايا بكفاءة عالية دون إتلافها. ويتم تحقيق ذلك من خلال توليد عامل الإيصال وتنقيته أولاً، ثم استخدام Dfta كخطوة ثانية.

يتم تحضين Dfta مع الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بوجود الحمولة الجزيئية الكبيرة المراد دراستها؛ حيث يحفز df tat امتصاص الحمولة داخل الحويصلات الالتقامية. تنضج الحويصلات لتتحول إلى جسيمات داخلية مبكرة، وصولاً في النهاية إلى مرحلة الجسيم الداخلي المتأخر حيث يتمكن DF tat من تحرير الحمولة في الحيز السيتوبلازمي للخلايا. بعد ذلك، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر الفلوري لتقييم كفاءة توصيل detta والحمولة المراد دراستها.

تظهر النتائج أن DF TT يمكنه دخول الخلايا بكفاءة عالية ودون سمية خلوية ملحوظة، كما يمكن لـ DF tat توصيل الجزيئات الكبيرة ذات الأحجام المختلفة إلى الحيز السيتوبلازمي للخلايا، وهو ما يمكن ملاحظته عبر المجهر الفلوري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بنهج التوصيل الصلبة الحالية في أن عامل التوصيل الخاص بنا يتمتع بكفاءة توصيل عالية دون أي تأثير سلبي ملحوظ على الفسيولوجيا الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه سهل الاستخدام حيث لا يتطلب سوى خطوة تحضين مشتركة بسيطة.

للبدء في تخليق FTA، يتم نقع 500 milligrams من راتنج R amide, MBHA وdimethylformamide أو DMF في وعاء SPPS قياسي سعة 50 milliliter لمدة ساعة واحدة، وتُجرى العملية في درجة حرارة الغرفة مع استخدام كمية كافية من غاز النيتروجين لفقاعة التفاعل. يتم تخليق FTA على راتنج rink amide MBHA باستخدام 1.2 millimoles من كل حمض أميني محمي بمجموعة FM المذكورة في البروتوكول النصي لكل تفاعل اقتران للأحماض الأمينية. يُضاف أيضاً 0.44 grams من HBTU و0.51 milliliters من DIEA المذاب في DMF، ويُجرى كل تفاعل اقتران للحمض الأميني لمدة أربع ساعات، وذلك بعد عملية الاقتران التي تستغرق أربع ساعات.

اغسل الراتنج باستخدام DMF وقم بخطوة حماية FD كما هو موضح في البروتوكول النصي. كرر العملية حتى يتم تخليق السلسلة الببتيدية الخطية لـ FTA. بعد ذلك، قم بإزالة مجموعة حماية MTT عن طريق تحضين الراتنج مع 20 milliliters من محلول يتكون من 1% tri Fluor acetic acid أو TFA و 2% tri isopropyl cy أو TIS في DCM لمدة خمس دقائق.

بما أن إزالة مجموعة الحماية MTT ستؤدي إلى ظهور لون أصفر، كرر هذه العملية حتى لا يلاحظ ظهور أي ألوان صفراء، مع غسل الراتنج بـ DCM وDMF بين الخطوات. أضف محلولاً إضافياً يحتوي على 1%TFA في DCM إلى الراتنج للتأكد من عدم إزالة أي MTT وبقاء المحلول شفافاً.

بعد ذلك، يتم إذابة T-M-R-H-B-T-U وDIEA في DMF وإضافة هذا المزيج إلى الراتنج. يتم إجراء التفاعل طوال الليل باستخدام النيتروجين الجاف لتوفير التقليب بعد حماية fm d واقتران الأحماض الأمينية. يُغسل الراتنج باستخدام DCM ويُترك ليجف من أجل الفصل الكامل للببتيد من الراتنج.

أضف محلولاً يحتوي على 92.5%TFA و 2.5% من الماء، و 2.5%TIS و 2.5% من ethane di thiol إلى راتنج الببتيد لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة لتحقيق إزالة الحماية الشاملة والفصل عن الراتنج. قم بترسيب نواتج الببتيد الخام باستخدام إيثر إيثيلي لا مائي بارد عن طريق تفريغ المحلول المُحضّر في 40 milliliters من eyl ether. قم بتركيز الراسب باستخدام جهاز الطرد المركزي عند درجة حرارة أربع درجات مئوية و 4,000 G لمدة تتراوح من 20 إلى 25 دقيقة.

كرر هذه الخطوة للسماح بغسل الراسب باستخدام إيثر الإيثيل اللامائي البارد. علّق الرواسب في الماء ثم قم بتجفيفها بالتجميد (lyophilize)، وبعد ذلك أعد تعليق النواتج التي تم الحصول عليها في محلول TFA المائي بتركيز 0.1% (ACEDONITE trial). أجرِ تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) باستخدام عمود تحليلي من نوع C 18.

لتحليل كل ببتيد، استخدم معدل تدفق قدره 1 mL/min والكشف عند 214 nm و 550 nm. بعد ذلك، قم بإجراء HPLC شبه تحضيري على عمود C 18 لتنقية الببتيد. استخدم معدل تدفق قدره 4 mL/min والكشف عند 214 nm و 550 nm لجميع عمليات التشغيل.

استخدم التدرجات الخطية قبل إجراء تفاعل الأكسدة. تحقق من الهوية الصحيحة للببتيدات باستخدام تقنية MALDI وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بإذابة FTA في محلول ملحي منظم بالفوسفات مهوّى.

تأكد من أن قيمة pH تتراوح بين 7.0 و7.5. بعد إضافة الببتيد، اترك التفاعل ليلة كاملة للسماح له بالوصول إلى الاكتمال. قم بتنقية المنتج باستخدام تقنية HPLC ذات الطور المعكوس وحلله عن طريق قياس الطيف الكتلي كما سبق، ثم قم بتجميد وتجفيف DF tat النقي، وأعد تعليقه في 200 µL من الماء لقياس التركيز.

أولاً، قم بإعادة تعليق كمية محددة من DF tat المنقى في 149 µL من محلول TCEP بتركيز 50 mM، واترك العينة لتتفاعل لمدة 20 دقيقة تقريباً. في هذه الخطوة، يتم اختزال DF tat إلى نظيره المونومري F tat للتخلص من إخماد الامتصاص الذي يحدث بسبب التقارب الشديد بين TMR floor four وDF tat. أضف جميع المحاليل إلى خلية كوارتز (CVE) وقم بقياس الامتصاص عند 556 nm.

باستخدام قانون بير، حدد تركيز المحلول. يتوافق هذا مع تركيز fta.

اقسم تركيز FTA على اثنين للحصول على تركيز dfta. قم بتنمية الخلايا في وسط مناسب حتى تصل نسبة الاندماج إلى 80 إلى 90% في جو مرطب عند درجة حرارة 37 degrees Celsius يحتوي على 5%CO2، ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 200 microliters من PBS ومرة واحدة باستخدام NRL 15. قم بتحضين الخلايا مع خمس micromolar من df tat مع أو بدون حمولة، مثل enhanced green fluorescent protein، وحافظ على درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة ساعة واحدة لتحفيز التسرب الإندوسومي بعد التحضين.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام الهيبارين في وسط L 15 لإزالة DF tat المرتبط بالغشاء البلازمي للخلايا. وكخطوة نهائية، قم بتصوير الخلايا باستخدام مجهر فلوري لتصوير DF tat باستخدام بروتين فلوري أحمر أو مرشح RFP لتقييم الفرق بين F TAT و D ftt. يتم تحضين خلايا HeLa مع كل ببتيد لتحديد الفرق في تموضعها الخلوي.

كما هو موضح هنا، يتمركز FTA بتوزيع منقط. ويتسق هذا التوزيع مع بقاء الببتيد محتجزاً داخل الإندوسومات. وفي المقابل، تظهر الإشارة الفلورية لـ dfta توزيعاً متجانساً في جميع أنحاء العصارة الخلوية والنواة.

يتم رصد التوزيع السيتوزولي لـ DF tat في عدد من الخطوط الخلوية المختلفة. وتُظهر الصور بتكبير 20x أن نسبة عالية جداً في الطبق تظهر توزيعاً سيتوزولياً لـ DF tat دون وجود سمية خلوية، كما يتضح من عدم وجود صبغ نووي بـ cyt blue، وذلك لتحديد ما إذا كان التسرب الإندوزومي بوساطة dfta يؤدي إلى إيصال البروتينات الكبيرة إلى سيتوزول الخلايا. وقد استُخدم EGFP للكشف عن إيصال البروتين المطوي بشكل صحيح.

أظهر EGFP توزيعاً فلورياً أخضر في السيتوبلازم والنواة، بشكل مشابه لما لوحظ في DF tat في أكثر من 90% من الخلايا دون سمية ملحوظة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه يجب ألا تكون الخلايا متراصة بشكل مفرط. بالإضافة إلى ذلك، يجب غسل الخلايا جيداً لإزالة FPS قبل إضافة df tap.