تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيل الجزيئات الكبيرة إلى الخلايا الحية باستخدام كاشف ثنائي أو فلورسنت أو df tat يمكنه اختراق الخلايا بكفاءة عالية دون إتلافها. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء وتنقية عامل التوصيل أولا. Dfta كخطوة ثانية.

يتم تحضين Dfta بالخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في وجود شحنة الجزيئات الكبيرة ذات الأهمية ، يحفز df tat امتصاص الشحنة داخل الحويصلات الداخلية. تنضج الحويصلات إلى الجسيمات الداخلية المبكرة ، وتصل أخيرا إلى مرحلة الجسيمات الداخلية المتأخرة حيث يكون DF tat قادرا على إطلاق الشحنة في الفضاء العصاري الخلوي للخلايا. بعد ذلك ، يتم تصوير الخلايا بواسطة المجهر الفلوري من أجل تقييم كفاءة تسليم دتا والبضائع ذات الأهمية.

تظهر النتائج أن DF TT يمكن أن يدخل الخلايا بكفاءة عالية ولا يمكن ملاحظة سمية خلوية يمكن أن تنقل جزيئات كبيرة بأحجام مختلفة إلى الفضاء العصاري الخلوي للخلايا كما يمكن ملاحظته بواسطة المجهر الفلوري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على أساليب التوصيل الصلبة الحالية هي أن وكيل التوصيل لدينا يتمتع بكفاءة توصيل عالية مع عدم وجود تأثير سلبي ملحوظ على فسيولوجيا الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فهو سهل الاستخدام لأنه لا يتطلب سوى خطوة حضانة مشتركة بسيطة.

للبدء ، ينتفخ تخليق FTA 500 ملليغرام من R amide وراتنج MBHA وثنائي ميثيل فورماميد أو DMF في وعاء قياسي 50 مليلتر SPPS لمدة ساعة واحدة لتنفيذ التفاعل في درجة حرارة الغرفة باستخدام ما يكفي من غاز النيتروجين لفقاعة التفاعل. قم بتجميع FTA على راتنج أميد MBHA باستخدام 1.2 ملليمول من كل حمض أميني محمي FM مدرج في بروتوكول النص لكل تفاعل اقتران للأحماض الأمينية. أضف أيضا نقطة 44 جراما من HBTU ونقطة 51 ملليلترا من DIEA المذاب في DMF ، وقم بتنفيذ كل تفاعل اقتران للأحماض الأمينية لمدة أربع ساعات بعد اقتران أربع ساعات.

اغسل الراتنج باستخدام DMF وقم بتنفيذ خطوة حماية FD كما هو موضح في بروتوكول النص. كرر حتى يتم تصنيع سلسلة الببتيد الخطية ل FTA. بعد ذلك ، قم بتجميع مجموعة حماية MTT عن طريق احتضان الراتنج ب 20 مل من محلول يتكون من 1٪ حمض الخليك ثلاثي الفلور أو TFA و 2٪ ثلاثي الأيزوبروبيل cy أو TIS في DCM لمدة خمس دقائق.

حيث أن إزالة مجموعة حماية MTT ستؤدي إلى ظهور اللون الأصفر. كرر هذا حتى لا تلاحظ أي ألوان صفراء تغسل الراتنج باستخدام DCM و DMF بينهما. أضف حلا إضافيا يحتوي على 1٪ TFA في DCM إلى الراتنج لضمان عدم إزالة MTT وبقاء المحلول واضحا.

بعد ذلك ، قم بإذابة T-M-R-H-B-T-U و DIEA في DMF وإضافة هذا الخليط إلى الراتنج. قم بإجراء التفاعل طوال الليل باستخدام النيتروجين الجاف لتوفير التحريض بعد حماية fm d واقتران الأحماض الأمينية. اغسل الراتنج باستخدام DCM واتركه يجف من أجل انقسام كامل للببتيد من الراتنج.

أضف محلولا يحتوي على 92.5٪ TFA و 2.5٪ ماء و 2.5٪ TIS و 2.5٪ إيثان دي ثيول إلى راتنج الببتيديل لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة لتحقيق حماية عميقة عالمية وانقسام من الراتنج. قم بترسيب منتجات الببتيد الخام باستخدام إيثيل الأثير اللامائي البارد عن طريق تصريف المحلول المحضر إلى 40 مل من إيثر إيل. قم بتدوير هذا عند أربع درجات مئوية و 4,000 جم لمدة 20 إلى 25 دقيقة.

كرر هذه الخطوة للسماح بغسل الراسب باستخدام إيثيل الأثير البارد اللامائي اللامائي. قم بتعليق الرواسب في الماء وتجميدها ثم قم بإعادة تعليق المنتجات التي تم الحصول عليها في تجربة TFA ACEDONITE المائية بنسبة 0.1٪. قم بإجراء كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء أو تحليل HPLC باستخدام عمود تحليلي C 18.

لتحليل كل ببتيد ، استخدم معدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة والكشف عند 214 نانومتر و 550 نانومتر. بعد ذلك ، قم بإجراء HPLC شبه تحضيري على عمود C 18 لتنقية الببتيد. استخدم معدل تدفق يبلغ أربعة ملليلتر في الدقيقة والكشف عند 214 نانومتر و 550 نانومتر لجميع عمليات التشغيل.

استخدم التدرجات الخطية قبل إجراء تفاعل الأكسدة. تأكد من الهوية الصحيحة للببتيدات بواسطة MALDI وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بإذابة اتفاقية التجارة الحرة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات الخلوي.

تأكد من أن الرقم الهيدروجيني يتراوح بين 7.0 و 7.5. بعد إضافة الببتيد ، قم بتحور التفاعل طوال الليل للسماح له بالتفاعل حتى الانتهاء. قم بتنقية المنتج باستخدام HPLC ذو الطور العكسي وقم بتحليله بواسطة قياس الطيف الكتلي كما كان من قبل ، قم بتجميد DF النقي وتعليق الإعادة في 200 ميكرولتر من الماء لقياس التركيز.

أولا ، قم بتعليق حصة منقاة من DF tat المنقى في 149 ميكرولتر من محلول TCEP 50 مليمولار يسمح للعينة بالتفاعل لمدة 20 دقيقة تقريبا. في هذه الخطوة ، يتم تقليل DF tat إلى نظيره المونومر F tat للتخلص من تبريد الامتصاص الذي يحدث بسبب القرب الشديد من الطابق الرابع TMR و DF tat. أضف جميع المحاليل إلى CVE الكوارتز وقم بقياس الامتصاص عند 556 نانومتر.

باستخدام قانون البيرة. تحديد تركيز المحلول. هذا يتوافق مع تركيز المناطق الحرة النيجيرية الحرة.

اقسم تركيز اتفاقية التجارة الحرة على اثنين للحصول على تركيز dfta. قم بزراعة الخلايا في وسط مناسب حتى 80 إلى 90٪ الطلاقة في جو مرطب 37 درجة مئوية يحتوي على 5٪ CO2 ، اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من PBS ومرة واحدة باستخدام NRL 15. احتضان الخلايا بخمسة ميكرومولار df tat مع أو بدون بضائع ، مثل البروتين الفلوري الأخضر المحسن واحتفظ به عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للحث على تسرب داخلي بعد الحضانة.

اغسل الخلايا ثلاث مرات بالهيبارين في وسط L 15 لإزالة DF tat المرتبط بغشاء البلازما للخلايا. كصورة للخطوة الأخيرة ، تستخدم الخلايا صورة المجهر الفلوري DF tat باستخدام بروتين فلوري أحمر أو مرشح RFP لتقييم الفرق بين F TAT و D ftt. يتم احتضان خلايا الكعب مع كل ببتيد لتحديد الفرق في توطينها الخلوي.

كما هو موضح هنا ، تقوم اتفاقية التجارة الحرة بترجمة في توزيع نقطي. يتوافق هذا التوزيع مع بقاء الببتيد محاصرا داخل الجسيمات الداخلية. في المقابل ، تعرض إشارة الفلورسنت ل dfta توزيعا متجانسا في جميع أنحاء العصارة الخلوية والنواة.

لوحظ توزيع العصارة الخلوية ل DF tat في عدد من خطوط الخلايا المختلفة. تظهر الصور 20 × أن نسبة عالية جدا في الطبق تعرض توزيعا عصاري خلوي ل DF tat بدون سمية خلوية كما يتضح من عدم وجود تلطيخ نووي أزرق cyt لتحديد ما إذا كان التسرب الداخلي بوساطة dfta يوفر بروتينات كبيرة في العصارة الخلوية للخلايا. تم استخدام EGFP للكشف عن توصيل البروتين المطوي بشكل صحيح.

أظهر EGFP توزيعا فلوريا أخضر علويا خلويا ونويا ، على غرار ما لوحظ ل DF tat في أكثر من 90٪ من الخلايا دون سمية ملحوظة أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخلايا لا ينبغي أن تكون شديدة التقاء. بالإضافة إلى ذلك ، يجب غسل الخلايا جيدا لإزالة FPS قبل إضافة صنبور df.