جيل من سرطان البروستاتا المريض المشتقة نماذج طعم أجنبي من تعميم الخلايا السرطانية

توضح هذه المخطوطة بالتفصيل طريقة مستخدمة لتوليد الطعوم الغريبة المشتقة من مرضى سرطان البروستاتا (PDXs) من الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs). يوفر إنشاء نماذج PDX من CTCs نموذجا تجريبيا بديلا لدراسة سرطان البروستاتا. الورم الأكثر شيوعا الذي يتم تشخيصه وسبب متكرر للوفاة من السرطان لدى الرجال.

الهدف العام من البروتوكول التالي هو توليد سرطان البروستاتا. الطعم الغريب المشتق من الخلايا السرطانية المنتشرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الدم المحيطي أولا من المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا المتقدم.

كخطوة ثانية ، يتم عزل حجرة الخلايا أحادية النواة في الدم ، والتي تحتوي على الخلايا السرطانية المنتشرة. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا أحادية النواة بجسم مضاد CD 45 ZI من أجل تحديد الخلايا السرطانية المنتشرة باستخدام قياس التدفق الخلوي ، يتم حقن الخلايا بعد ذلك في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تظهر النتائج توليد الطعوم الغريبة لسرطان البروستاتا بناء على حقن الخلايا السرطانية المنتشرة المعزولة عن طريق قياس التدفق الخلوي من الدم المحيطي لمرضى سرطان البروستاتا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان البروستاتا من خلال إنشاء نماذج تجريبية جديدة يمكن استخدامها للتوصيف الجزيئي لسرطان البروستاتا وتطوير مؤشرات حيوية جديدة. سيوضح الإجراء ويليامز ، وهو طالب من المختبر وعومادا ، باحث من قسم الأورام هنا في Mount Sinai للبدء في جمع الدم الكامل من مرضى مختارين يعانون من سرطان البروستاتا النقيلي لأن لديهم القدرة على وجود أعداد كبيرة من الخلايا السرطانية المنتشرة في دمائهم المحيطية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر ، انقل الدم كله إلى أنبوب مخروطي بوليسترين سعة 50 مليلتر ، جنبا إلى جنب مع محلول ملح توازن هانك.

بنسبة واحد إلى واحد، قم بعمل ماصة الخليط برفق لتجانسه. بعد ذلك ، أضف 15 مل من محلول حزمة استدعاء FI إلى أنبوب مخروطي بوليسترين فارغ سعة 50 مل. قم بسحب 20 مل من الدم الكامل المخفف برفق، باستخدام أدنى إعداد أعلى المحلول لتشكيل طبقة علوية مميزة.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 Gs لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، اضبط تباطؤ جهاز الطرد المركزي على أدنى إعداد لمنع خلط المحاليل بعد الفصل. بعد الطرد المركزي ، حدد الشريط الرقيق والأبيض والرمادي لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة والخلايا السرطانية المنتشرة المحصورة بين الطبقة العليا للبلازما ومحلول الفصل.

في الجزء السفلي من الأنبوب ، اجمع الخلايا بعناية من الشريط الرمادي الأبيض وانقلها إلى أنبوب بوليسترين سعة 50 مل. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، ثم أضف هانك. موازنة محلول الملح للخلايا المعزولة بحجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.

الطرد المركزي الخليط مرة أخرى عند 400 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. من أجل غسل الخلايا ، قم بإزالة المادة الطافية وكرر هذا الغسيل. خطوة مرة أخرى.

بعد الغسيل الثاني ، تخلص من المادة الطافية. الحبيبات المتبقية في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء ، واحتضان المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 400 Gs لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل عن طريق التخلص من المادة الطافية.

أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS مكملا بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين قبل تلطيخه. حدد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد trian blue القياسية على hemo أو مقياس الخلوي أو عداد الخلايا الآلي. ثم قم بتخفيف الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر في PBS مع 10٪ FBS ، وضعها على الجليد لمدة ساعة واحدة.

لمنع الارتباط غير المحدد ، قم بتوزيع تعليق الخلية في أنبوبين منفصلين. قم بتسمية أنبوب واحد لخلايا التحكم وآخر لخلايا صبغة CD 45 في أنبوب التحكم. أضف IgG واحد كابا زي عند تخفيف واحد إلى 250 إلى تركيز نهائي قدره 10 نانوجرام لكل ملليلتر.

في أنبوب تلطيخ CD 45. أضف الجسم المضاد الأولي المترافق CD 45 ZI بنفس تركيز 10 نانوجرام لكل مليلتر واحتضان معلقات الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 جيجابايت لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم تخلص من الخنط.

اغسل الخلايا مرتين عن طريق تعليق كل حبيبات في PBS معقم مكمل بنسبة 10٪ FBS متبوعا بالطرد المركزي عند 400 Gs لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الريسوس ، قم بتعليق الخلايا في محلول مليلتر واحد من PBS يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من البقعة الرقيقة. قم بتصفية المحلول النهائي من خلال أغطية مصفاة 35 ميكرومتر إلى أنابيب البوليسترين مقاس 12 ملم × 75 ملم من أجل استبعاد أي كتل أو حطام من الخلايا.

ثم استبعد الخلايا الموجبة CD 45 والخلايا الميتة من المعلق باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لإزالتها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. امزج معلق الخلايا السرطانية في البروستاتا مع بروتينات المصفوفة خارج الخلية بنسبة واحد إلى واحد وضع الخليط على الثلج. بعد ذلك ، قم بتخدير فم الذكور الذين يعانون من نقص المناعة البالغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع وفقا للإرشادات المؤسسية باستخدام 5٪ من الفلور الأيزو المستنشق في لتر واحد في الدقيقة من الأكسجين.

تأكد من التخدير المناسب عن طريق التحقق من فقدان منعكس القرنية وإصبع القدم في الفأر. ارسم 250 ميكرولترا من تعليق الخلية باستخدام إبرة قياس 25 وحقنة سعة مليلتر واحد. ثم حقن الحجم الكامل لتعليق الخلية المصفوفة خارج الخلية تحت الجلد في كلا الجانبين العلويين من أورام مراقبة الفأر عن طريق إجراء الجس الأسبوعي لمواقع حقن الفئران لنمو الكثافة العقدية تحت الجلد.

بناء على طريقة الاختيار السلبية المستخدمة في هذا البروتوكول ، من الضروري استبعاد الخلايا الميتة باستخدام صبغة DAPI. كما هو موضح هنا ، فإن النسبة المئوية للخلايا السالبة CD 45 من الخلايا القابلة للحياة المتبقية متغيرة وتعتمد على عبء الورم للمريض ، ولكن يمكن فصلها بسهولة عن الخلايا الإيجابية CD 45. عند استخدام البوابات المناسبة ، بعد زرع تعليق الخلايا السرطانية في البروستاتا ، ستصبح الكثافة العقدية تحت الجلد مرئية على جانبي الفأر.

تمثل كل كثافة عقدية نمو الطعم الغريب ويمكن تقديرها على أنها متميزة عن الأنسجة السليمة لأنها تبرز من العضلات الظهرية للفأر وتكون أكثر صلابة في الملمس. تلخص نماذج الطعم الغريب المشتقة من المريض الناتجة عن الخلايا السرطانية المنتشرة أورام البروستاتا البشرية كما يتضح من تلطيخ الهيمات والتوين واليوزين ، والكيمياء المناعية للعلامات الخلوية الخاصة بالبروستاتا مثل مستقبلات الأندروجين ومستضد الغشاء الخاص بالبروستاتا بعد توليد الطعوم الغريبة. يمكن إجراء بروتوكولات أخرى مثل توصيف التعبير الجيني أو البروتيني لاستكشاف الآليات الخلوية والجزيئية التي تساهم في عدوانية سرطان البروستاتا.