تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

يتمثل الهدف العام من حقن صبغة إيفانز الزرقاء (Evans Blue Dye) ودكسترين فيتزي (Fitzy Dextrin) في الوريد الرئيسي الشائع في ملاحظة سلامة غشاء العضلات الهيكلية في أسماك الزيبرا الحية، وذلك للمساعدة في توصيف الآليات المسببة للأمراض المتعلقة بأنواع مختلفة من الحثل العضلي. يمكن أن يساعد حقن صبغة إيفانز الزرقاء في الكشف عن الآليات البيولوجية التي تساهم في باثولوجيا المرض عند توصيف النماذج الحيوانية للإصابة بالحثل العضلي، كما يمكن أن يساهم في فهمنا للآليات العلاجية المحتملة لعلاج المرض. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تنفيذها وتحليلها باستخدام أسماك الزيبرا الحية.

بالإضافة إلى ذلك، يمثل الحقن المشترك لـ Fitz Dextrin ضابط جودة لضمان نجاح عملية الحقن، مما يعزز الدقة والتقدير الكمي. وتتعلق آثار هذه التقنية بفائدتها في التحقق من صحة نماذج zebrafish المصابة بأمراض العضلات. كما أنها تعزز فهم كيفية تسبب طفرات معينة في ظهور أنماط مرضية لعضلات الجسم، مثل الحثل العضلي، وهو أمر بالغ الأهمية لإيجاد العلاجات والأدوية الشافية.

لتحضير أطباق الحقن بوسط الآغار، قم بغلي تركيز يتراوح بين 2 إلى 3% من الآغار في وسط E3، واترك المحلول ليبرد قليلاً على طاولة المختبر. صب حوالي 35 ملليلتر من الآغار المبرد في كل طبق بقطر 100 ملم. بعد ذلك، ضع أحد طرفي قالب الحقن المفضل في المحلول قبل وضع بقية القالب على محلول الآغار.

اترك محلول الأغار ليتصلب إما في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 °C لمدة 30 دقيقة تقريباً. بعد ذلك، استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لفصل أحد طرفي القالب عن الأغار المتصلب، ثم قم بإزالة بقية القالب ببطء. قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 1% من صبغة إيفانز الزرقاء (Evan's Blue Dye) أو EBD في محلول رينجر (ringer solution) بتركيز 1x.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول مخزون من Fitz Dextrin في محلول ringer 1x واحفظه عند درجة حرارة -20 °C. ولتحضير خليط الحقن، خفف EBD إلى تركيز 0.1% مباشرة في محلول Fitz Dextrin المخزون، ثم قم برج خليط الحقن جيداً باستخدام جهاز vortex، واحفظه بعيداً عن الضوء المباشر عن طريق لف الأنبوب بورق ألومنيوم قبل الحقن. قم بتدفئة لوحة الحقن مسبقاً حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بترتيب الميكرومانيبوليتور (micro manipulator) على لوحة معدنية وبجوار مجهر الحقن. قم بتشغيل وحدة التحكم في الحقن الدقيق التي تعمل بالهواء. بعد ذلك، قم بملء إبرة الحقن من الخلف باستخدام ما يقرب من 2 إلى 4 µL من خليط EBD.

بعد ذلك، قم بمعايرة حجم الحقن باستخدام حوالي 5 nanoliters من مزيج EBD. ثم استخدم محلول ringer بتركيز 1x لترطيب لوحة الحقن وأزل المحلول الزائد من الآبار؛ قم بمعالجة اليرقات مسبقاً بـ 0.04% tricaine مخفف في محلول ringer بتركيز 1x لشل حركة اليرقات تماماً قبل الحقن باستخدام ماصة زجاجية. ضع اليرقات المخدرة في آبار لوحات الحقن اللولبية، مع التأكد من وجود اليرقات بالكامل داخل الآبار وهي مستلقية على جوانبها.

أزل محلول الـ trica الزائد لتقليل حركة اليرقات داخل البئر، مع ترك كمية كافية لمنع الجفاف. ضع لوحة حقن اليرقات على مجهر تشريحي ووجّه إبرة ماصة الحقن التي تحتوي على الـ EBD. قم بالحقن فوق يرقات zebrafish بالقرب من القلب وبزاوية 45 درجة تقريبًا من المحور الأمامي الخلفي.

أدخل إبرة الحقن في الوريد الكاردينالي المشترك أو CCV بالقرب من الجزء الأمامي من المح، حيث ينعطف الوريد في البداية باتجاه ظهري. بعد ذلك، احقن 5 nanoliters من خليط EBD وأبقِ إبرة الحقن في موضعها لمدة تتراوح من 5 إلى 8 ثوانٍ. ولتقليل التسرب الفوري لخليط EBD، يجب أن يظهر الحقن الجيد وجود الصبغة في غرف القلب، ويمكن تكرار العملية.

إذا لم يتم رصد EB DMX في القلب مباشرة بعد عملية حقن ناجحة، فسوف يراكم الجنين Fitz Dextrin في الأوعية الدموية كما هو موضح هنا. بعد حقن العدد المطلوب من اليرقات، أعد اليرقات إلى محلول one x ringer بدون trica في أطباق قطرها 100 millimeter لزيادة معدل البقاء على قيد الحياة والحفاظ على قوة الإشارة. احتفظ بالأطباق ملفوفة في ورق ألومنيوم.

تُحضن اليرقات عند 28.5 درجة مئوية لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات لضمان امتصاص فعال لـ EBD. ولتصور EBD في العضلات، استخدم 0.04% trica لتخدير اليرقات قبل فحصها تحت الفلورة الحمراء. تم حقن EBD في CCV للطفرات المتجانسة Sapia والأشقاء من النوع البري في مرحلة 3D PF؛ وقد ملأت الحقنات غرف القلب كما هو موضح هنا، ثم حُللت لضمان نجاح تروية الصبغة عن طريق تصور fitzy dextrin في الأوعية الدموية تحت الفلورة الخضراء.

بعد فترة حضانة دامت أربع ساعات، تم فحص امتصاص صبغة EBD على مستوى القطعة العضلية (somite) كما هو موضح في هذا الشكل. لم تظهر الأشقاء من النوع البري أي فلورة لصبغة EBD داخل أي من الألياف العضلية المرئية، بينما أظهرت الطفرات متماثلة الزيجوت من نوع sapia امتصاصاً لصبغة EBD، مما يشير إلى تلف في الغشاء العضلي. وبمجرد إتقان عملية حقن صبغة إيفانز الزرقاء (Evans blue dye) في الوريد الرئيسي المشترك لأسماك الزيبرا، يمكن إتمام العملية ليرقات الأسماك في غضون 30 إلى 60 دقيقة اعتماداً على عدد اليرقات التي يتم حقنها.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على النتائج التجريبية في يوم واحد لضمان الكفاءة. ومن المهم تذكر التصويب بدقة نحو الوريد الرئيسي من أجل الحصول على نتائج متسقة وقابلة للتفسير، وهو أمر قد يكون صعباً ويتطلب على الأرجح التدريب على اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص الكيميائي والجيني من أجل تحديد الآليات الجزيئية المسؤولة عن تلف الغشاء المرتبط بضمور العضلات. ويمكن لهذه التجارب أن تساعد في وضع استراتيجيات علاجية جديدة لأمراض العضلات بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث أمراض العضلات لاستكشاف سلامة الغشاء في نماذج سمك الزيبرا المصابة بضمور العضلات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم شامل لكيفية حقن صبغة إيفانز الزرقاء (Evan's blue dye) في الوريد الأساسي المشترك ليرقات سمك الزيبرا. يجب أن تفهم أيضاً كيفية تحديد الألياف العضلية التي تعاني من تلف في الغشاء بسبب وجود صبغة إيفانز الزرقاء داخل هذه الألياف.