دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور توزيع وقياس اتحادية مستقبلات عامل نمو البشرة أو EGFRs في الغشاء البلازمي للخلايا السليمة والرطبة باستخدام المجهر الفلوري والمجهر الإلكتروني. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق تنمية خلايا تعبر عن EGFR، مثل cos seven، على رقائق دقيقة تحتوي على غشاء رقيق من نيتريد السيليكون بسمك 50 nanometer يغطي منطقة نافذة تقع في المركز. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا مع نسخة مبيوتنة من عامل نمو البشرة الذي يرتبط بالمستقبل ويغير شكل EGFR، مما يؤدي إلى التضاعف والتنشيط.

بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا من أجل شل حركة المستقبلات، ثم تُحضن مع نقاط كمومية مقترنة بـ Hagen منزوعة لترتبط بالمستقبلات المنشطة بـ EGF، ومن ثم يتم تصوير الخلايا. وأخيراً، يؤدي التثبيت الثاني باستخدام الغلوتارالدهيد إلى إيجاد روابط متصالبة بين نقاط الكم المقترنة بـ Hagen المنزوعة وبين EGFR، مما يثبت العينة من أجل المجهر الإلكتروني. تُظهر النتائج انبعاث الفلورة الحمراء من خلال تصوير النقاط الكمومية الفلورية، وتوزيع EGFR والحالة القياس اتحادية أو التجمع عبر المجهر الإلكتروني النافذ الماسح.

توفر هذه الطريقة معلومات فريدة حول هندسة التوزيع وتوزيع مستقبلات الغشاء في الخلايا السليمة، ويمكن استخدامها للحصول على رؤى حول تنشيط مستقبل عامل نمو البشرة في الخلايا الطبيعية وفي الخلايا السرطانية. كما يمكن تطبيقها لدراسة مستقبلات غشائية أخرى مثل القنوات الأيونية. للبدء، يتم العمل تحت غطاء كيميائي. وبالنسبة لخطوات التحضير الأولى لرقائق نتريد السيليكون الغشائية الميكروية، وبعد غمرها في الأسيتون وفقاً للبروتوكول النصي، تُنقل الرقائق الميكروية مباشرة إلى بيكر يحتوي على الإيثانول والانتظار لمدة دقيقتين، ثم تُزال الرقائق من الإيثانول وتوضع على منديل خاص بالغرف النظيفة.

عندما تجف الرقائق، انقلها إلى شريحة زجاجية وُضعت مسبقاً في طبق بتري. ثم ضع الغطاء على الطبق. بعد ذلك، ضع الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الرقائق الدقيقة في جهاز تنظيف بالبلازما.

قم بتشغيل برنامج تنظيف قياسي لمدة خمس دقائق لجعل سطح غشاء نيتريك السيليكون محبًا للماء. بعد ذلك، وتحت غطاء التدفق الصفائحي، انقل الرقاقات الدقيقة من الزجاج. مررها على منديل مخصص للغرف النظيفة قبل وضعها في فجوة من طبق يحتوي على 24 فجوة مملوءة بمحلول بولي L-لايسين أو PLL، ثم قم بالتحضين لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، انقل الرقاقات الدقيقة واحدة تلو الأخرى إلى بئر ثانٍ يحتوي على ماء بدرجة نقاء HPLC قبل شطفها في بئر ثانٍ من الماء. وأخيرًا، ضع الرقاقات الدقيقة بشكل فردي في آبار مملوءة بـ DM في لوحة ذات 96 بئرًا، ثم ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون باستخدام مزارع خلوية فرعية من COS بسبع خلايا. قم بتحضير معلق خلوي أحادي التشتت بتركيز يقارب 5 × 10^.

الخلايا لكل مليلتر. أضف قطرة واحدة من معلق الخلايا إلى كل شريحة ميكروية في طبق 96 بئراً، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق باستخدام مجهر مقلوب. ابدأ بفحص مناطق الشرائح الميكروية للوصول إلى كثافة تقريبية تتراوح بين 20 إلى 30 خلية لكل نافذة بمساحة 150 by 400 micrometer.

عندما تلتصق الخلايا بشكل كافٍ، انقل الرقاقات الدقيقة بعناية بحيث تكون المسافات الفاصلة بين الخلايا متجهة للأعلى إلى آبار جديدة تحتوي على dm. وعندما يتبقى عدد كافٍ من الخلايا الملتصقة، انقل الرقاقات الدقيقة بحيث تكون الخلايا متجهة للأعلى إلى آبار جديدة تحتوي على serum free dmm. بعد ذلك، قم بحضن الرقاقات الدقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لعدة ساعات أو طوال الليل للخطوات التالية.

باستخدام صفيحة ذات 96 بئراً، املأ الآبار بالمحاليل اللازمة واستخدم صفاً أو عموداً واحداً لكل شريحة مجهرية. اشطف الشرائح المجهرية بوضعها في بئر يحتوي على B-S-A-G-E-L-P-B-S طازج وحضنها عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس دقائق. انقل الشرائح المجهرية إلى محلول EGF biotin بتركيز 300 nM وأعدها إلى الحاضنة لمدة ثلاث دقائق لأن الخلايا ستبدأ في إدخال EGF المسمى egfr.

قم بشطف الرقائق الدقيقة بسرعة باستخدام PBS ثلاث مرات. ثم استخدم محلول cate المنظم بتركيز 0.1 مولار أو CB لشطف العينات. بعد ذلك، انقل الرقائق الدقيقة إلى 3%PFA واتركها للتحضين لمدة 10 دقائق.

بعد الشطف مرة واحدة باستخدام CB وثلاث مرات باستخدام PBS، انقل الرقاقات إلى G-L-Y-P-B-S واحضنها لمدة دقيقتين. بعد ذلك، استخدم PBS للشطف مرتين. الآن، ضع الرقاقات الدقيقة في 10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D لمدة 10 دقائق قبل الشطف أربع مرات باستخدام B-S-A-P-B-S.

بعد ذلك، اغمر شريحة ميكروية واحدة في طبق زجاجي القاع بقطر 35 مليمتر مملوء مسبقاً بمحلول B-S-A-P-B-S في درجة حرارة الغرفة لتصوير الخلايا باستخدام مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) والمجهر الفلوري. استخدم عدسة شيئية هوائية بقوة 40 x لالتقاط صور عامة للخلايا الملحقة بـ QD 6 55. استخدم مكعب ترشيح يقوم باستثارة النقاط الكمومية بين 340 و380 نانومتر مع انبعاث أعلى من 420 نانومتر.

قم بتقليل شدة الضوء لتجنب الإضاءة القوية التي قد تتسبب في تلف العينة. اضبط وقت التعرض على 300 milliseconds على الأقل لضمان التقاط إشارات جميع الـ qds، وبما أن وميض فلورة الـ QD يتغير، قم بتعديل شدة الضوء والتكبير لتوفير صور ساطعة دون ضوضاء مرئية في الصورة مع تقليل شدة الضوء إلى أدنى حد. بعد التصوير، أعد وضع الرقيقة الدقيقة في صفيحة 96 wall plate تحتوي على B-S-A-P-B-S.

اشطف مرة واحدة في cb، ثم انقل إلى glutaraldehyde بتركيز 2% وحضن لمدة 10 دقائق بعد ذلك. اغسل CB واستخدم B-S-A-P-B-S لغسل الرقاقة الدقيقة ثلاث مرات، ثم خزنها في آبار مملوءة مسبقاً بـ B-S-A-P-B-S في لوحة 96 بئر جديدة لكل رقاقة دقيقة. املأ صفاً مكوناً من أربعة آبار بماء من درجة HPLC.

بعد إعداد جهاز ESEM وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتحميل العينة في منصة pre-COOL ESEM STEM عن طريق إخراج طبق 96 WAT من حاوية التبريد ووضعه بالقرب من منصة ESEM المفتوحة. ضع منديلاً مخصصاً للغرف النظيفة بجانبه. اشطف الرقاقة الدقيقة بسرعة عن طريق غمرها أربع مرات لمدة ثانية واحدة في كل مرة في بئر مملوء بماء من درجة HPLC.

جفف الجزء الخلفي من الرقاقة الدقيقة بسرعة باستخدام المنديل الورقي، ثم ضعها في المنصة المبردة مسبقاً مع ثلاث ميكرولتر من ماء HPLC المبرد. بلل سطح العينة وثبت العينة في المنصة. بعد ذلك، ضع ثلاث قطرات إضافية من الماء بحجم ثلاث ميكرولتر لكل منها على المنصة بالقرب من العينة، ثم أغلق حجرة العينة.

بعد تحديد الخلية المراد دراستها، قم بتسجيل صورة عامة للخلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح النافذ (STEM) وفقاً للبروتوكول المكتوب، ثم انتقل إلى منطقة محيطية من الخلية حيث تكون حدود الخلية مرئية، وقم بالتكبير حتى تصل إلى تكبير 50,000 X. سجل صوراً تُظهر النقاط الكمومية (qds) الفردية، واستخدم أزمنة استقرار بكسل تتراوح بين 20 إلى 30 ميكروثانية؛ وتظهر هنا نقاط كمومية من نوع QD 6 55 موسومة لبروتين EGFR المرتبط بالغشاء في خلايا COS seven سليمة ورطبة تماماً. توضح صورة تباين التداخل التفاضلي (DIC) هنا تضاريس غشاء الخلايا، بينما تُظهر صورة الفلورسنت المقابلة توزيع EGFR على كامل سطح الخلية بعد ثلاث دقائق من الحضانة مع EGF البيوتين.

تكشف صور ESEM STEM هذه ذات التكبير المنخفض عن بنيات دقيقة مثل القدم الخيطية (filopodia) التي تمتد من الخلية نحو الخلايا المجاورة وبعض البنيات داخل المناطق الخلوية الأكثر رقة. وتظهر المناطق الخلوية المركزية السميكة، بما في ذلك النواة، باللون الأبيض لأن نفاذ الإلكترونات ذات الطاقة المستخدمة عبر العينة غير ممكن. دقة عالية.

تظهر صور ESEM STEM للمناطق الطرفية الأكثر رقة وجود ملصقات QD على طية غشائية تعبر الصورة قطرياً. يمتلك هذا التركيب الغشائي كثافة EGFR أعلى من مناطق الغشاء المحيطة في عدة مواقع، حيث كان هناك ملصقان على مسافة قريبة من بعضهما البعض. تم الإشارة برؤوس أسهم إلى مثالين بمسافات تبلغ 20 و24 nanometers.

تُفسر أزواج العلامات هذه على أنها تنتمي إلى EGF Fers. تم تسجيل هذه الصورة لمنطقة ذات كثافة EGFR وإشارة فلورية أقل. ومع ذلك، وُجد EGFR هنا أيضاً في شكل ثنائيات، كما كان هناك وجود لمجموعتين تتكون كل منهما من 10 أو 11 EEG.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إتمام تحضير العينات في غضون ساعتين، وهو أسرع بكثير من التقنيات المستخدمة عادةً في المجهر الإلكتروني. ويمكن أن يوفر تصوير essem STEM اللاحق ما يصل إلى 100 صورة عالية الدقة خلال نصف يوم.