رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة خلل تنظيم الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية بمرور الوقت باستخدام بروتين مراسل مُفرز. ويتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الجينات بوساطة ناقل فيروسي إلى النسيج المستهدف، وتحديداً الكبد. في هذا المثال الذي يستخدم مراسل Gai luciferase circa، يتم جمع سائل بيولوجي مجاور، مثل الدم، لقياس كمية circa التي أفرزها النسيج، ثم تُضاف مادة الركيزة الخاصة بإنزيم luciferase إلى عينات البلازما ويُقاس التألق الحيوي لتحديد استنفاد الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية.

تظهر النتائج خللاً في تنظيم الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية كما يتضح من زيادة مستويات C camp في البلازما، ويمكن مراقبة التوازن الداخلي للكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية على فترات ممتدة من خلال أخذ عينات متكررة بأحجام صغيرة من السوائل البيولوجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل صبغات الكالسيوم منخفضة الألفة، أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً، في إمكانية مراقبة التوازن الداخلي للكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية داخل الجسم الحي بمرور الوقت عبر إجراء بسيط وغير جراحي. وهناك مساران علاجيان لهذه التقنية.

يتمثل الهدف الأول في فحص الأدوية التي يمكنها الحفاظ على التوازن الداخلي للكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية أو استعادته إلى الحالة الفسيولوجية الطبيعية. أما النهج الثاني فهو تعديل البروتين العلاجي ليصبح بروتينات علاجية مُضخمة (amps) حيث يحدث إفرازها استجابةً لنضوب الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية. ومن شأن هذه الطريقة أن توفر رؤية أعمق حول خلل تنظيم الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية في الكبد.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أعضاء أخرى مثل الدماغ، أو القلب، أو العضلات، أو البنكرياس. بعد تخدير جرذ من سلالة sprat dolly وفقاً لبروتوكول النص، ضع مرهم العين وقم بقرص الذيل للتحقق من التخدير، ثم احلق منطقة البطن من أسفل الأضلاع قليلاً وصولاً إلى منتصف منطقة البطن، وقم بتطهير المنطقة الجراحية ثلاث مرات بالتناوب بين Betadine و70%ethanol. بعد ذلك، ضع الجرذ في وضعية الاستلقاء الظهري على منطقة جراحية معقمة وقم بتغطيته بأغطية جراحية معقمة، ثم خفف a v gluc samp إلى التركيز الذي يحسنه المستخدم.

في هذه الحالة، استخدمنا 7.6 × 10⁹ جينوم فيروسي لكل ملي لتر، وتم الخلط عن طريق قلب الأنبوب. بعد ذلك، يتم سحب 105 µL من A a V المخفف ونقله إلى طبق معقم، واستخدام إبرة قياس 30 لتجميع الفيروس داخل محقنة. يتم تحديد موقع الشق المستهدف للكشف عن الكبد من أجل الحقن باستخدام مشرط.

أجرِ شقاً أفقياً بطول يتراوح بين سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات أسفل القفص الصدري. استخدم التشريح الكليل لفصل النسيج الضام عن طبقة ما تحت الجلد. اقطع العضلة البطنية للكشف عن الفص الإنسي الأيمن للكبد.

بعد ذلك، ضع الحيوان تحت مجهر جراحي واضبط الرؤية لجعل الفص الإنسي الأيمن للكبد في مجال الرؤية. ثم باستخدام المحقنة، احقن ثلث الحجم الإجمالي للفيروس في ثلاثة مواقع في متن الفص الإنسي الأيمن، مع ترك الإبرة في النسيج لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ بعد الحقن لضمان توصيل كامل حجم الحقنة، ثم قم بخياطة العضلات البطنية والشق الجراحي واستخدم مسحة قطنية لوضع Neosporin. ضع الجرذ في غرفة تعافٍ حتى يستعيد وعيه ويصبح قادرًا على الحفاظ على وضعية قائمة قبل إعادة الحيوان إلى قفص مسكن فردي.

بعد مرور أربعة إلى سبعة أيام من الحقن. يتم تجهيز أنابيب جمع الدم عن طريق وضع الملصقات عليها ووزنها مسبقاً. ثم يُضاف 50 µL من الهيبارين بتركيز 1000 units/mL إلى كل أنبوب.

بعد تخدير الجرذ وفقاً للبروتوكول المذكور في النص، قم بقرص الذيل للتحقق من التسكين، وباستخدام مقص معقم، اقطع طرف الذيل على بُعد حوالي 1 إلى 2 ملم من النهاية. اجمع أكثر من 100 µL من الدم على شكل قطرات في أنبوب مملوء مسبقاً بالهيبارين لوقف النزيف.

استخدم مسحة قطنية مبللة لوضع مسحوق STIC على الذيل. استخدم وسادة إيثانول لمسح المقص وتعقيمه بالخرزة بين عمليات الجمع. احفظ أنابيب الدم عند درجة حرارة 4 °C.

عند جمع عينات لاحقة، يتم وزن أنابيب الجمع وضبط كمية الهيبارين للحصول على نسبة دم إلى هيبارين تبلغ 2:1. ستعمل هذه الخطوة على توحيد كمية الهيبارين في كل عينة. يتم طرد الأنابيب مركزياً عند 2000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق.

انقل الطافي من البلازما إلى أنبوب جديد واحفظه في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 72 ساعة أو في درجة حرارة -80 °C للتخزين طويل الأمد لاستخدامه في مقايسة اللوسيفيريز (luciferase assay) لإعطاء thaa garin كعنصر تحكم إيجابي. خففه في الإيثانول ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2.5 mg/mL. ثم احقنه بجرعة 1 mg/kg داخل الصفاق في أسفل البطن.

قم بسحب عينة الدم الأولى بعد 24 ساعة من الحقن كما هو موضح أعلاه. ولقياس التألق الحيوي، قم بتحضير الركيزة العاملة من selen ezine وفقاً لبروتوكول النص، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء لمدة 30 دقيقة.

في هذه الأثناء، يتم إذابة جميع العينات على الثلج ونقل 10 µL من البلازما إلى لوحة ذات جدران معتمة باستخدام قارئ لوحات قادر على مراقبة التلألؤ البيولوجي ومجهز بحاقن للمادة الركيزة. يتم تحضير الخطوط بالمادة الركيزة، ثم حقن 100 µL من المادة الركيزة في البئر.

رُجّ العينات بسرعة متوسطة لمدة خمس ثوانٍ وقس انبعاث الضوء للعينات المختبرية (in vitro). قم بتكامل انبعاث الضوء على مدى 0.5 ثانية لخطوة القراءة، وبالنسبة للعينات الحية (in vivo)، قم بالتكامل على مدى خمس ثوانٍ في خطوة القراءة لتقييم التوازن الداخلي لكالسيوم الشبكة الإندوبلازمية. وباستخدام طريقة Gluc SAR Camp، يمكن تضمين عدة ضوابط، مثل مراسل يُفرز بشكل مستمر مثل Gluc Noag في هذه الحالة.

تُعتبر الزيادة في المستويات خارج الخلوية لكل من GLUC SAR camp و Gluc noag استجابةً للظروف التجريبية نتيجةً غامضة. ومع ذلك، فإن زيادة إفراز gluc SAR camp مع عدم وجود استجابة لـ gluc noag تدعم حدوث واقعة تعتمد على كالسيوم الشبكة الإندوبلازمية (ER calcium). ويمكن استخدام المُعدِّلات الدوائية لمخزون كالسيوم الشبكة الإندوبلازمية لتأكيد مساهمة كالسيوم الشبكة الإندوبلازمية في تحرير SAR camp في النماذج التجريبية الجديدة.

على سبيل المثال، وكما هو موضح هنا، فإن الدانتيرولين (dantrolene)، وهو مضاد لمستقبلات INE يعمل على تثبيت كالسيوم الشبكة الإندوبلازمية (ER)، يثبط إطلاق SAR camp استجابةً لـ thic argon. وبالنسبة للدراسات المختبرية (in vitro) التي تستخدم SAR camp القائم على الجلوكوز، فمن الأفضل تقييم الاستجابة الناجمة عن العلاج على مدار المجرى الزمني. ومن خلال تتبع التغيرات في الاستجابة النسبية داخل اللوحة الواحدة مقارنة بالمجموعات الضابطة، لا يُنصح بمقارنة الأرقام الخام عبر لوحات متعددة، حيث يمكن أن يؤدي تحلل المادة الركيزة إلى تغيرات في القيم الخام. أما بالنسبة للدراسات الحيوية (in vivo)، فيجب تقييم البيانات بشكل مستقل لكل حيوان، بحيث يعمل كل حيوان كعنصر تحكم خاص به قبل المعالجة.

هذا أمر ضروري لمراعاة التباين في نقل التعبير الجيني والجين المنقول بين الحيوانات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية sircam لاستقصاء تنظيم الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية في نماذج القوارض المصابة بأمراض الكبد. لا تنسَ أن العمل مع النواقل الفيروسية قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.