إإكسبلنتس الشبكية كاملة من الدجاج الأجنة لعلاج Electroporation للوالكيميائية الكاشف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح غرسات شبكية كاملة من أجنة الدجاج تجريبياً، ومعالجتها واستزراعها. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع كلتا العينين من جنين دجاج ووضعهما في طبق بتري. تتمثل الخطوة الثانية في إزالة الصلبة والظهارة الصبغية باستخدام ملاقط دقيقة.

بعد ذلك، يتم إخضاع المستأصل الشبكي بالكامل لعملية التثقيب الكهربائي لـ plasmid DNA باستخدام أقطاب كهربائية دائرية مسطحة. وتتمثل الخطوة النهائية في تحضين المستأصل الشبكي في وسط زراعة، وذلك داخل طبق يحتوي على 24 بئراً في الحاضنة.

وفي النهاية، يتم تثبيت غرسات الشبكية بأكملها، وتقطيعها بالتبريد (cryo sectioned)، ثم تحليلها بواسطة مجهر الفلورة المناعي لتصور عصبونات الشبكية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل العمليات الكهربائية في البيضة (OVO)، في كونها سريعة وسهلة التنفيذ وتضمن نتائج قابلة للتكرار. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال تطور الجهاز العصبي المركزي، مثل كيفية تأثر تكوين العصبونات بكواشف كيميائية محددة مثل مثبطات الإنزيمات أو نواتج الجينات التي تستهدف دورة الخلية بعد فترة الحضانة.

ضع البيض في العمر الجنيني المطلوب داخل غطاء التدفق الصفائحي، وامسح قشور البيض بـ 70%ethanol لتجنب تلوث الجنين. انقر على جانب البيضة بقوة مقابل سطح صلب لكسرها، ثم ضع المحتويات في طبق بتري بقطر 100 millimeter. استخدم ملعقة صغيرة لنقل الجنين إلى طبق بتري بقطر 35 millimeter يحتوي على PBS تم تسخينه مسبقاً عند 37 درجة مئوية لمنع جفاف الأنسجة.

بعد ذلك، قم بفصل رأس الجنين وضع طبق بتري بقطر 35 مليمتر الذي يحتوي على أنسجة الجنين على مجهر ستيريو ثنائي العينين في غطاء التدفق الصفائحي، واستخدم ملقطًا دقيقًا لإجراء شق عبر الفم في الجهة البطنية للعين. وبدءًا من موقع الشق، قم بتمزيق الأنسجة المحيطة بالعين بالكامل.

بعد ذلك، قم بقطع العصب البصري وإزالة العين السليمة من محجر العين. اجمع العينين اليسرى واليمنى من الجنين نفسه لاستخدامهما إما كعين ضابطة أو عين معالجة. استخدم ملعقة صغيرة لنقل العينين إلى طبق بتري جديد بقطر 35 مليمتر يحتوي على PBS مُدفأ مسبقًا باستخدام ملقط دقيق.

قم بإزالة جميع الأنسجة المحيطة بالعين، بما في ذلك الصلبة والجفن. بعد ذلك، اصنع شقاً صغيراً في الظهارة الصبغية عند الجزء الظهري من العين، مع الحرص على عدم إتلاف الشبكية العصبية. ثم قم بتمزيق الظهارة الصبغية برفق بدءاً من موقع الشق.

اترك العدسة والشبكية بأكملها متصلة بالجسم الزجاجي. قم بإزالة الظهارة الصبغية، مع توخي الحذر عند الجسم الهدبي حول الحدقة في المنطقة الأمامية من العين، وعبر الشق المشيمي نظراً لصعوبة إزالتها من هذه المواقع. قم بتشغيل جهاز التثبيت الكهربائي واضبط الجهد على 15 فولت لشبكية في المرحلة 20 إلى 25، أو 20 فولت لشبكية في المرحلة 26 إلى 27.

بعد ذلك، اضبط تكرارات النبض على خمس نبضات مدة كل منها 50 milliseconds، مع فاصل زمني قدره ثانية واحدة بين كل نبضة وأخرى. استخدم مولد نبضات يمكن التحكم فيه بواسطة دواسة قدم أرضية، حيث ستكون كلتا اليدين مطلوبتين لتثبيت الأقطاب الكهربائية في مكانها. قم بتوصيل قطبين كهربائيين من البلاتين على شكل مجداف مصنعين خصيصاً بمقبس المخرج في مولد النبضات.

صُنعت الأقطاب الكهربائية الموضحة هنا من ألواح بلاتين بسمك 0.1 مليمتر، وكان سلك التوصيل بقطر 0.8 مليمتر معزولاً. باستخدام أنابيب بلاستيكية، انقل مستأصل الشبكية كاملاً بعناية إلى وعاء باستخدام ماصة باستور من البولي إيثيلين تم قطع طرفها. تجنب استخدام رؤوس الماصات لأن الشبكية تميل إلى الالتصاق بالبلاستيك والتمزق.

بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 100 µL لإزالة كل كمية PBS المحيطة بالاستئصال الشبكي برفق. احرص على عدم لمس الشبكية لتجنب تمزيقها. أضف 100 µL من محلول البلازميد المخفف إلى QVE وتأكد من تغطية الاستئصال الشبكي بالكامل بالمحلول.

اضغط بلطف على مستخلص الشبكية باستخدام الملقط إذا طفا إلى الأعلى. استخدم أقطاب الملقط لتوجيه العدسة بحيث تواجه أي جانب من الـ vete وتوجيه العصب البصري إلى قاع الـ vete. بعد ذلك، ضع القطب الموجب أمام العدسة والقطب السالب خلف الشبكية دون لمس الأنسجة.

قم بتطبيق التيار عن طريق الضغط على دواسة القدم، وتحقق من وجود فقاعات عند الأقطاب الكهربائية، مما يشير إلى حدوث تفريغ ناجح. استخدم ماصة سعة 100 µL لإزالة جميع خليط البلازميد من الـ qve دون إتلاف الشبكية. يمكن إعادة استخدام خليط البلازميد من ثلاث إلى خمس مرات بعد إزالة البلازميد.

املأ الأنبوب (vete) بمحلول PBS المسخن مسبقاً. استخدم الملاقط لفصل مستأصل الشبكية بلطف عن جدار الأنبوب. ثم استخدم الماصة ذات الطرف البولي إيثيليني لنقل مستأصل الشبكية كاملاً إلى لوحة ذات 24 بئراً تحتوي على 1 mL من وسط الزرع المسخن مسبقاً.

يتم تحضين شريحة شبكية واحدة فقط في كل بئر من الوسط. تُحضن شريحة الشبكية عند 37 درجة مئوية و5%CO2 على هزاز دوار بسرعة ثابتة تبلغ 50 RPM. يضمن الدوران أقصى تعرض للوسط ومنع التصاق الشبكية بقاع طبق الـ 24 بئراً.

بعد 24 ساعة من الزرع، ظهرت الخلايا الموجبة لـ GFP في جزء كبير من الشبكية السليمة، حيث أدى التثقيب الكهربائي إلى امتصاص منطقة واسعة من الشبكية للبلازميد والتعبير عن الجين المراسل. وبعد إجراء التقطيع النسيجي، تم اكتشاف الخلايا الموجبة لـ GFP المنفردة بسهولة على طول المحور القاعدي لـ ACO في الشبكية. ويمكن زرع شريحة الشبكية الكاملة لمدة أطول بنحو 24 ساعة تقريبًا.

قد تؤدي أوقات الحضن إلى تأخر نمائي، وتشوهات مورفولوجية، وموت خلوي مبرمج، وفي النهاية تحلل الشبكية. تم إجراء صبغ مناعي لمقطع من مستنبت شبكي كامل تم استزراعه لمدة 24 ساعة باستخدام phospho histone three، والذي يظهر هنا في القناة الحمراء؛ حيث يقوم phospho histone three بتمييز الخلايا في مرحلة G2/M المتأخرة. وقد وُجدت الخلايا الموجبة لـ pH three على الجانب القمي للشبكية، وهو ما يتوافق مع التطور الطبيعي للشبكية.

كما هو موضح هنا، يمكن تثبيط هذا التطور عن طريق إضافة مثبط لـ CDK 1/2؛ حيث أدت الحضانة مع المثبط لمدة أربع ساعات قبل التصوير إلى تقليل عدد الخلايا الموجبة لـ pH 3 في الشبكية بشكل ملحوظ بعد تطورها. لقد استُخدمت هذه التقنية بنجاح لاستقصاء التعبير الجيني المُبلغ عنه من بلازميد DNA جديد، ولمعاملة مستنبتات الشبكية بكواشف كيميائية، بما في ذلك منظمات مسار تلف DNA ودورة الخلية. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عمليات التثقيف الكهربائي في الجسم الحي (In vivo electroporation) من أجل تأكيد النتائج بشكل أكبر.