كاسباس 3 النشاط في الفئران اللوزة تقاس Spectrofluorometry بعد احتشاء عضلة القلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط caspase-3 في لوزة الدماغ لدى الجرذ بعد حدوث احتشاء عضلة القلب باستخدام القياس الطيفي الفلوري. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال العلوم العصبية السلوكية، مثل تداعيات احتشاء عضلة القلب على الأداء المعرفي، والصحة النفسية، وعملية الشيخوخة، والنوم. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها بسيطة وسريعة وموثوقة.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأنها تتطلب مهارة يدوية في الجراحة وأخذ عينات الأنسجة. ستقوم كيم جيلبرت، وهي مساعد بحث في مختبرنا، باستعراض هذا الإجراء. بعد تحريض التخدير وفقاً للبروتوكولات المؤسسية المعتمدة، تأكد من إتمام التخدير بشكل صحيح من خلال غياب رد فعل قرص القدم.

قم بإجراء التنبيب للجرذ باستخدام أنبوب رغامي ووضع الحيوان في وضعية الاستلقاء البطني على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 degrees Celsius. صِل الأنبوب الرغامي بجهاز تخدير يضخ 2%isofluorane. بعد ذلك، قم بتحضير الموقع الجراحي باستخدام جلوكونات الكلورهيكسيدين وكحول الإيزوبروبيل.

ثم ضع مرهمًا للعين في كلتا العينين لمنع الجفاف. ضع غطاءً معقماً فوق الحيوان لإنشاء مجال معقم حول موقع الجراحة. وضع الأدوات الجراحية المعقمة المطلوبة على مجال معقم آخر بجانب الحيوان.

بعد ذلك، يتم إجراء شق في الجلد باستخدام شفرة مشرط رقم 10 أو مقص. استخدم مقصاً أو ملقطاً مرقئاً لإزالة الأنسجة العضلية. ثم استخدم المقص أو الملقط المرقئ لفتح الجدار الصدري ووضع مباعد الصدر، وافتح التأمور باستخدام الملقط المرقئ.

لإحداث انسداد في الشريان التاجي، قم أولاً بعمل حلقة بخيط جراحي حريري مقاس 4-0 وطوله 360 مليمتر حول الشريان التاجي النازل وعبر أنسجة عضلة القلب المجاورة. أدخل كلا طرفي الخيط الحريري في أنبوب بلاستيكي مقاس 14 وقطره 1.25 سنتيمتر. اسحب طرفي الخيط الحريري وادفع الأنبوب للأسفل باتجاه الشريان لإغلاقه.

قم بتثبيت الانسداد عن طريق ضغط الأنبوب البلاستيكي باستخدام مشبك مرقئ، وحافظ على هذا الانسداد لمدة 40 دقيقة. بعد مرور 40 دقيقة، قم بفك الانسداد عن طريق إزالة المشبك المرقئ، ثم إزالة الأنبوب المرن وخيط الحرير. أغلق الصدر باستخدام خيط جراحي قياس 2-0، ومرر قسطرة مرنة عبر التجويف الصدري واسحب الهواء من الصدر باستخدام حقنة سعة 10 milliliter لمنع حدوث استرواح الصدر.

خيط العضلة باستخدام خيط جراحي حريري قياس 4-0، والجلد باستخدام خيط جراحي حريري قياس 3-0. قبل إغلاق الغرزة الأخيرة من الجلد، قم بسحب الهواء مرة أخرى من الصدر باستخدام حقنة سعة 10 milliliter وقثطرة. أكمل إغلاق الجلد ثم أوقف مادة isofluorane.

ضع الجرذ في قفص نظيف وراقبه خلال مرحلة التعافي من التخدير. قم بإعطاء المسكنات بجرعات متكررة كل ثماني ساعات. بعد قطع رأس الحيوان بطريقة رحيمة وفقاً للإجراءات المعتمدة، ضع رأس الجرذ في طبق موضوع فوق ثلج مجروش.

استخدم المقص لفتح الجمجمة. ثم استخدم المقراضات (rongeurs) لفصل أغمدة العظام دون إتلاف الأنسجة الأساسية عن طريق السحب للأعلى. بعد ذلك، ضع الطرف المسطح للملعقة (spatula) بين قاعدة الجمجمة والسطح البطني الخلفي للدماغ، وافصل الدماغ عن الجمجمة عن طريق دفع النصل للأمام برفق، مما يؤدي إلى رفع الدماغ خارج الجمجمة.

ضع الدماغ على سطحه الظهري. حدد موقع تحت المهاد أمام المخيخ، ثم اقطع الدماغ قطعًا إكليلية أمام النهاية الخلفية لتحت المهاد وأيضاً خلف النهاية الأمامية. حدد موقع اللوزتين الثنائيتين ككرتين صغيرتين أسفل الفصوص الصدغية بجوار تحت المهاد مباشرة.

ثم اقلب الدماغ ليكون مسطحاً على طرفه الجبهي بحيث يكون السطح الظهري بعيداً عن الباحث. بعد ذلك، افصل نصفي الكرة المخية وأزل القشرة عن اللوزة الدماغية المستمرة. وعندما تظهر اللوزة الدماغية، قم باستئصالها باستخدام المشرط.

قم بالقص على طول الغرزة الداكنة التي تمتد عبر اللوزة لفصل الأجزاء القاعدية الجانبية والمركزية الإنسية، ثم ضع الجزأين في أنابيب منفصلة وموسومة على الثلج. يجب تنفيذ هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن لمنع تدهور الإنزيمات. بعد تكرار إجراء التشريح في نصف الكرة المخية الآخر، اغمر جميع الأنابيب الأربعة في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة، ثم خزنها في مجمد بدرجة حرارة -80 °C.

ابدأ بإضافة 150 µL من محلول التحلل (lysis buffer) إلى كل 5 إلى 10 mg من العينة على الثلج. قم بمعالجة كل عينة بالموجات فوق الصوتونية (sonication) على الثلج بأقصى كثافة لمدة خمس ثوانٍ. بعد ذلك، تُحضن العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة.

أثناء فترة التحضين، قم برج العينة باستخدام جهاز vortex لمدة خمس ثوانٍ كل خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد والإذابة عن طريق وضع العينات بالتناوب في النيتروجين السائل وعلى لوح تسخين مضبوط حرارياً عند 37 °C. بعد دورة التجميد والإذابة النهائية، قم بطرد عينات الأنسجة مركزياً عند 1300 Gs في درجة حرارة أربع °C لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بسحب السائل الطافي بعناية وانقله إلى أنبوب جديد على الثلج. بعد تقدير كمية البروتين وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب، أضف 25 micrograms من البروتين إلى أنبوب تفاعل يحتوي على 0.8 microliter من 10 millimolar Ac-DEVD-AMC ومحلول منظم للتفاعل ليصل الحجم النهائي إلى 200 microliters. وبالنسبة لعينات التفاعل السالبة، اخلط 25 micrograms من البروتين مع 1 microliter من 800 micromolar Ac-DEVD-CHO و0.8 microliters من 10 millimolar Ac-DEVD-AMC.

حضّن جميع العينات وعينات الضبط في الظلام لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة Celsius. بعد انقضاء وقت التحضين، أوقف التفاعل بإضافة 600 µL من glycine بتركيز 0.4 molar وsodium hydroxide بتركيز 0.4 molar عند pH 10 في كل عينة وعينة ضبط. أضف 2 mL من الماء المقطر إلى كل تفاعل في كوفيت زجاجية.

قم بقياس كمية الفلورية عن طريق قياس الطيف الفلوري. اقرأ عينات الضبط والعينات التجريبية لمدة 10 ثوانٍ، بمعدل قراءة واحدة كل ثانية. وأخيراً، قم بقياس النشاط النوعي في كل عينة وفقاً للمعادلة المعروضة الآن على الشاشة.

يوضح هذا المدرج التكراري نشاط caspase-3 في اللوزة الدماغية لجرذان تعرضت لاحتشاء عضلة القلب. تم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من متوسط النشاط في مجموعات التحكم الوهمية التي تم تحديدها بنسبة 100%. تألفت كل مجموعة من ثمانية جرذان. تشير النجمة إلى وجود فرق معنوي بين المجموعات بقيمة p أقل من 0.05.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون سبع ساعات، باستثناء الفترة الفاصلة بين جراحة احتشاء عضلة القلب وأخذ عينات الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز احتشاء عضلة القلب في الجرذ وقياس نشاط caspase-3 في لوزة الجرذ باستخدام القياس الطيفي الفلوري.