كاسباس 3 النشاط في الفئران اللوزة تقاس Spectrofluorometry بعد احتشاء عضلة القلب

احتشاء عضلة القلب (MI) لا يتبعه فقط ضعف وظائف القلب ولكن أيضا بموت الخلايا المبرمج في اللوزة ، وهي منطقة دماغية تشارك في العواقب السلوكية ل MI. يصف هذا البروتوكول كيفية تحفيز MI ، وجمع أنسجة اللوزة وقياس نشاط caspase-3 ، وهو علامة على موت الخلايا المبرمج ، فيه.

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط كاسباز -3 في اللوزة الدماغية للفئران بعد احتشاء عضلة القلب باستخدام قياس الطيف الفلوري. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلوم العصبية السلوكية ، مثل عواقب احتشاء عضلة القلب على الأداء المعرفي والصحة العقلية وعملية الشيخوخة والنوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسريعة وموثوقة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب البراعة في الجراحة وأخذ عينات من الأنسجة. سيوضح الإجراء كيم جيلبرت ، مساعد باحث في مختبرنا. بعد تحريض التخدير وفقا للبروتوكولات المؤسسية المعتمدة ، تأكد من التخدير المناسب من خلال عدم وجود منعكس قرصة المخلب.

بتنبيب الفئران بأنابيب القصبة الهوائية وضع في وضع الاستلقاء البطني على وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. قم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية بآلة تخدير توزع 2٪ متشابهة فلور. بعد ذلك ، قم بإعداد موقع الجراحة باستخدام غلوكونات الكلورهيكسيدين وكحول الأيزوبروبيل.

وضعي مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف. ضع ستارة معقمة فوق لإنشاء حقل معقم حول موقع الجراحة. ووضع الأدوات الجراحية المعقمة المطلوبة في حقل معقم آخر بجوار.

بعد ذلك ، شق الجلد بشفرة مشرط أو مقص رقم 10. استخدم مقصا أو مشبك مرقئ لتقشير الأنسجة العضلية. ثم استخدم مقصا أو مشبك مرقئ لفتح الجدار الصدري ووضع ضام الصدر ، وفتح التامور باستخدام المشبك المرقئ.

للحث على انسداد الشريان التاجي ، قم أولا بلف خياطة حريرية بطول 360 ملم حول الشريان التاجي الهابط ومن خلال أنسجة عضلة القلب المتجاورة. أدخل طرفي خياطة الحرير في أنبوب بلاستيكي بطول 14 سم. اسحب طرفي الخيط الحريري وادفع الأنبوب لأسفل على الشريان لإغلاقه.

قم بتأمين الانسداد عن طريق تثبيت الأنبوب البلاستيكي بمشبك مرقئ والحفاظ على الانسداد لمدة 40 دقيقة. بعد 40 دقيقة ، حرر الانسداد عن طريق إزالة المشبك المرقئ ثم الأنبوب المرن والخياطة الحريرية. أغلق الصدر بخياطتين صفريتين وضع قسطرة مرنة عبر التجويف الصدري واسحب الهواء من الصدر باستخدام حقنة سعة 10 مليلتر لمنع استرواح الصدر.

بغرزة العضلات بأربعة خياطة حريرية صفرية والجلد بثلاثة خياطة حريرية صفرية. قبل إغلاق آخر خياطة جلدية ، اسحب الهواء مرة أخرى من الصدر باستخدام حقنة وقسطرة سعة 10 ملليلتر. قم بإنهاء إغلاق الجلد ثم أوقف الأيزوفلوران.

ضع الجرذ في قفص نظيف وراقبه أثناء التعافي من التخدير. تطبيق التسكين مع تكرار الجرعات كل ثماني ساعات. بعد قطع رأس بشكل إنساني وفقا للإجراءات المعتمدة ، ضع رأس الجرذ على طبق يوضع على الثلج المجروش.

استخدم المقص لفتح الجمجمة. ثم استخدم rongeurs لفصل الحزم العظمية دون تشويه الأنسجة الأساسية عن طريق السحب لأعلى. بعد ذلك ، ضع الشفرة المسطحة للملعقة بين الجزء السفلي من الجمجمة والسطح البطني الخلفي للدماغ وافصل الدماغ عن الجمجمة عن طريق دفع الشفرة برفق للأمام ، ورفع الدماغ من الجمجمة.

ضع الدماغ على سطحه الظهري. تحديد منطقة ما تحت المهاد أمام المخيخ وقطع الدماغ إكليليا أمام الطرف الخلفي لمنطقة ما تحت المهاد وأيضا خلف الطرف الأمامي. حدد اللوزة الثنائية على أنها كرتين صغيرتين أسفل الفصوص الصدغية بجوار منطقة ما تحت المهاد.

ثم اقلب الدماغ بشكل مسطح على نهايته الأمامية مع السطح الظهري بعيدا عن المجريب. بعد ذلك ، افصل نصفي الكرة الأرضية وقم بإزالة القشرة من اللوزة المستمرة. عندما يتم الكشف عن اللوزة ، اقطع اللوزة بمشروط.

اقطع على طول الخيط الداكن الذي يمتد عبر اللوزة لفصل الأجزاء القاعدية الجانبية والأجزاء الوسطى الإنسي ثم ضع الجزأين في أنابيب منفصلة على الجليد. يجب القيام بهذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لمنع تدهور الإنزيمات. بعد تكرار إجراء التشريح مع نصف الكرة الآخر ، اغمر جميع القوارير الأربعة في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة ثم قم بتخزينها في الفريزر سالب 80 درجة مئوية.

ابدأ بإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل لكل خمسة إلى 10 ملليغرامات من العينة على الجليد. قم بإجراء كل عينة على الجليد بأقصى كثافة لمدة خمس ثوان. ثم احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.

أثناء الحضانة ، قم بدوامة العينة لمدة خمس ثوان كل خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإجراء ثلاث دورات تجميد وذوبان عن طريق وضع العينات بالتناوب في النيتروجين السائل وعلى لوحة تسخين يتم التحكم فيها حراريا عند 37 مرسوما مئوية. بعد دورة الذوبان بالتجميد النهائي ، قم بالطرد المركزي لعينات الأنسجة عند 1300 جي ثانية عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية بعناية ونقلها إلى أنبوب جديد على الجليد. بعد تحديد كمية البروتين وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب ، أضف 25 ميكروغراما من البروتين إلى أنبوب تفاعل يحتوي على 0.8 ميكرولتر من 10 ملليمولار Ac-DEVD-AMC ومخزن مؤقت للتفاعل لحجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر. بالنسبة لعينات التفاعل السلبي ، اجمع بين 25 ميكروغراما من البروتين مع ميكرولتر واحد من 800 ميكرومولار Ac-DEVD-CHO و 0.8 ميكرولتر من 10 ملليمولار Ac-DEVD-AMC.

احتضان جميع العينات وأدوات التحكم في الظلام لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد انقضاء وقت الحضانة ، أوقف التفاعل ب 600 ميكرولتر من 0.4 مولار جلايسين و 0.4 مولار هيدروكسيد الصوديوم عند درجة الحموضة 10 في كل عينة والتحكم. أضف ملليلترين من الماء المقطر إلى كل تفاعل في كوفيت زجاجي.

تحديد كمية التألق عن طريق قياس الطيف الفلوري. اقرأ عناصر التحكم والعينات لمدة 10 ثوان مع قراءة واحدة كل ثانية. أخيرا ، حدد نشاطا محددا في كل عينة وفقا للصيغة المعروضة الآن على الشاشة.

يظهر هذا الرسم البياني نشاط كاسباز -3 في اللوزة الدماغية للفئران التي خضعت لاحتشاء عضلة القلب. يتم التعبير عن البيانات على أنها النسبة المئوية لمتوسط النشاط في الضوابط الوهمية المحددة على 100٪ تتكون كل مجموعة من ثمانية فئران. تشير العلامة النجمية إلى وجود اختلاف معتد به بين المجموعة بقيمة p أقل من 0.05.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في سبع ساعات باستثناء الفترة الفاصلة بين جراحة احتشاء عضلة القلب وأخذ عينات من الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث احتشاء عضلة القلب في الفئران وقياس نشاط كاسباز 3 في اللوزة الدماغية في الفئران باستخدام قياس الطيف الفلوري.