تنقية ماوس سفن الدماغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية القسم الوعائي من دماغ الفأر مع الحفاظ على سلامته الهيكلية، وذلك باستخدام سلسلة من عمليات الطرد المركزي منخفضة السرعة وعمليات الترشيح دون الحاجة إلى أجسام مضادة محددة أو سلالات معدلة وراثياً. وقد بُذلت جهود عديدة لتطوير تقنيات تسمح بإجراء تحقيقات خلوية وجزيئية ودوائية على الحاجز الدموي الدماغي. إن غياب عمليات الفصل، أو التدرجات، أو الأعمدة، أو خطوات الطرد المركزي عالية السرعة يجعل تنقية الأوعية الدماغية بواسطة هذا الإجراء سهلاً للغاية وسريعاً وغير مكلف.

ستظل أوعية الدماغ سليمة هيكلياً مع إغلاق الخلايا البطانية بواسطة الوصلات المحكمة ومحاطة بصفائح الغشاء القاعدي، ومعظم خلايا العضلات الملساء الوعائية، والأغشية النجمية حول الوعائية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بوظيفة الحجيرة الوعائية للحاجز الدموي الدماغي والسماح بدراسة تركيبها الجزيئي؛ حيث سيقوم بتقديم الإجراء باحث ما بعد الدكتوراه من فريق Martin Coen S. قبل البدء في الإجراء، قم بقطع الجزء السفلي من الجزء العلوي اللولبي لحامل المرشح.

ثم استخدم المشرط لعمل شق في الجلد من رقبة الفأر وصولاً إلى الأنف وقم بسحب الجلد للخلف. اغسل الجمجمة باستخدام PBS لإزالة أي شعيرات ملوثة، ثم أدخل مقصاً في الجمجمة أمام البصيلات الشمية. افتح المقص لكسر الجمجمة إلى أجزاء وقم بإزالة الدماغ باستخدام الملعقة المسطحة.

بعد ذلك، قم بتشريح الضفيرة المشيمية من البطينات الجانبية وانقل الدماغ إلى دورق سعة 150 milliliter يحتوي على 20 milliliters من محلول B one على الثلج. ثم استخدم مشرطين لتقطيع الدماغ بقوة إلى قطع نسيجية بحجم 2 millimeter، واستخدم مجانسًا آليًا لتجنيس النسيج لمدة 20 شوطة بسرعة 400 RPM على الثلج. ولتنقية الأوعية، انقل المادة المتجانسة إلى أنبوب بلاستيكي سعة 50 milliliter وقم بتدوير ملاط النسيج في جهاز الطرد المركزي.

في جهاز طرد مركزي ذو دوار متأرجح، ستتكون واجهة بيضاء كبيرة تتكون أساساً من الميالين على الجزء العلوي من الراسب في الوعاء. تخلص من السائل الطافي وأضف 20 milliliters من محلول B two المبرد بالثلج، ثم رج الأنبوب بقوة لمدة دقيقة واحدة. بعد عملية طرد مركزي ثانية، سيشكل الميالين طبقة بيضاء كثيفة عند سطح السائل الطافي.

قم بتدوير الأنبوب ببطء للسماح لمحلول B two بالتدفق على طول الجدار أثناء صبه، وتخلص من الميالين مع السائل الطافي. ثم استخدم ماصة بلاستيكية ملفوفة بورق ماص لإزالة أي سائل متبقٍ من جدران الأنبوب. مع الحرص على عدم لمس راسب الحويصلات، اقلب الأنبوب رأساً على عقب وضعه على الثلج.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الراسب في 1 مل من محلول B3 المبرد بالثلج، ثم أضف 5 مل أخرى من محلول B3 مع الحرص على عدم تكوين تجمعات في الأوعية. الآن، ضع مرشحاً من شبكة النايلون بمسامية 20 ميكرون فوق دورق بيكر، وقم بموازنة المرشح باستخدام 10 مل من محلول B3 المبرد بالثلج. صب تحضير الأوعية فوق المرشح واغسل الأوعية بعناية باستخدام 40 مل أخرى من محلول B3 المبرد بالثلج.

بعد ذلك، استخدم ملقطاً نظيفاً لنقل المرشح فوراً إلى كأْس يحتوي على 30 milliliters من محلول B three طازج، واغسل الأوعية الموجودة في المرشح عن طريق الرج اللطيف. صب محتويات الكأس في أنبوب بلاستيكي سعة 50 milliliter. ثم بعد عملية الطرد المركزي، أعد تعليق الراسب في 1 milliliter من محلول B three المبرد بالثلج قبل إجراء الصبغ المناعي.

انقل الأوعية إلى أنابيب PCR سعة 0.2 milliliter وضع الأنابيب على الثلج حتى يترسب نسيج الأوعية في قاع الأنابيب. بعد ذلك، استخدم رؤوس تحميل الهلام (gel loading tips) لسحب معظم السائل. تالياً، أدخل شعيرة زجاجية مسيلكونة (Siliconized) بقطر 40 micrometer في رأس ماصة P 200، واستخدم الشعيرة لنقل الأوعية إلى شريحة زجاجية، وعندما تستقر الأوعية، قم بإزالة السائل بعناية باستخدام قطعة من الورق الماص.

بعد ذلك، ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت على الأوعية، ثم ضع غطاء الشريحة بزاوية 45 درجة، مع السماح لوسط التثبيت بالانتشار على طول حافة الزجاج حتى يستقر غطاء الشريحة في مكانه. في هذه الصورة، يمكن ملاحظة وسم RIN المستمر حول الخلايا البطانية العصبية، مما يؤكد الاحتفاظ بالصفيحة القاعدية على الأوعية المنقاة. كما تم الكشف عن مكونات الوصلات المحكمة البطانية، مثل ZO one، على الأوعية المنقاة أيضاً.

علاوة على ذلك، يشير وسم NG two وأكتين العضلات الملساء إلى الاحتفاظ بالطفيليات السليمة وخلايا العضلات الملساء الوعائية على التوالي. كما يتم الكشف عن بروتينات غشاء الخلايا النجمية المحيطة بالأوعية connection 43 وAquaporin four على سطح الأوعية المنقاة، مما يدل على الاحتفاظ الإضافي بأغشية الخلايا النجمية المحيطة بالأوعية أثناء عملية التنقية، ومع ذلك، لوحظت فقط ألياف قصيرة ومشتتة إيجابية لـ GFAP على الأوعية المعزولة، مما يكشف أن أجسام الخلايا النجمية لم يتم تنقيتها بشكل مشترك. وتظل فقط القليل من الألياف العصبية مرتبطة بالأوعية.

وبالمثل، لم يتم الكشف عن خلايا موجبة لـ IBA one و oli two، مما يؤكد عدم التنقية المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن. ونوصي بشدة بإزالة الضفيرة الحالية قبل تجانس الدماغ، حيث وجدنا أنها مصدر محتمل للتلوث، كما ننصح بالعمل في منطقة نظيفة وتجنب التلوث بالشعر والغبار؛ نظراً لأن الأجسام المضادة تمتلك ألفة غير متخصصة عالية تجاه هذه المواد.

من المهم أيضاً إجراء صبغ نووي دائماً. ومن الممكن إزالة خلايا الدم من الأوعية المُنقاة عن طريق إجراء تروية داخل القلب باستخدام PBS قبل استخلاص الأوعية. لقد نجحنا في استخلاص الأجسام المضادة والبروتينات من أوعية نُقيت بهذه الطريقة من شرائح وعائية مُحضرة حديثاً أو مجمدة.

لقد استخدمنا أيضاً المسابير الفلورية والمجهر البؤري لدراسة وظيفة النقل البطانية للأوعية الدموية خارج الجسم الحي. نتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.