تنقية ماوس سفن الدماغ

الهدف العام من الإجراء هو تنقية حجرة الأوعية الدموية في دماغ الفأر مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية ، باستخدام سلسلة من أجهزة الطرد المركزي والترشيحات منخفضة السرعة دون الحاجة إلى أجسام مضادة محددة أو سلالات معدلة وراثيا. وقد بذلت جهود كثيرة لتطوير تقنيات تسمح الخلوية, الجزيئي, والتحقيقات الدوائية للحاجز الدماغي الدماغ. إن عدم وجود فصل أو تدرجات أو قولون أو خطوات طرد مركزي عالية السرعة يجعل تنقية أوعية الدماغ من خلال هذا الإجراء أمرا سهلا وسريعا وغير مكلف.

ستبقى أوعية الدماغ سليمة من الناحية الهيكلية مع الخلايا الإندوت المختومة بواسطة تقاطع العلامة وتحيط بها الطفيليات القاعدية ، ومعظم خلايا العضلات الوعائية S ، والأغشية الفلكية حول الأوعية الدموية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بوظيفة حجرة الأوعية الدموية CE والسماح بدراسة تركيبها الجزيئي الذي يوضح أن الإجراء سيكون أول ما بعد الدكتوراه من فريق Martin Coen S. قبل البدء في الإجراء ، قم بقطع الجزء السفلي من الجزء العلوي من حامل الفلتر.

ثم استخدم مشرطا لشق الجلد من عنق الفأر إلى الأنف وسحب الجلد للخلف. اغسل الجمجمة باستخدام PBS لإزالة أي شعر ملوث ، ثم أدخل مقصا في الجمجمة الأمامية للبصيلات الشمية. افتح المقص لتمزيق الجمجمة إلى أجزاء وإزالة الدماغ باستخدام الملعقة.

بعد ذلك ، قم بتشريح الضفيرة المشيمية من البطينين الجانبيين ونقل الدماغ إلى دورق سعة 150 مليلتر يحتوي على 20 مل من محلول B واحد على الجليد. ثم استخدم مشرطين لتقطيع الدماغ بقوة إلى شظايا ملليمترية من الأنسجة ، واستخدم الخالط السفلي الآلي لتجانس الأنسجة لمدة 20 ضربة عند 400 دورة في الدقيقة على الجليد. لتنقية الأوعية ، انقل الجانس إلى أنبوب بلاستيكي سعة 50 مليلتر وقم بتدوير ملاط الأنسجة.

في جهاز الطرد المركزي الدوار المتأرجح ، ستتشكل واجهة بيضاء كبيرة تتكون في الغالب من المايلين في الجزء العلوي من حبيبات السفينة. تخلص من المادة الطافية عند 20 مل من محلول المثلج البارد B ، وقم بهز الأنبوب بقوة لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي الثاني ، سيشكل المايلين طبقة بيضاء كثيفة على سطح المادة الطافية.

قم بتدوير الأنبوب ببطء للسماح للمحلول B Two بالجري على طول الجدار أثناء سكبه وتخلص من المايلين مع المادة الطافية. ثم استخدم ماصة بلاستيكية ملفوفة بورق ماص لإزالة أي سائل متبقي من جدران الأنبوب. الحرص على عدم لمس حبيبات الوعاء وقلب الأنبوب رأسا على عقب على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول المثلج البارد B ثلاثة ، متبوعا بإضافة خمسة ملليلتر أخرى من B ثلاثة محلول مع الحرص على عدم تكوين الأوعية الركام. الآن ضع مرشحا شبكيا من النايلون 20 ميكرون فوق قارورة بيكر وقم بموازنة الفلتر ب 10 مل من محلول المثلج البارد B ثلاثي. صب مستحضر الوعاء على الفلتر واشطف الأوعية بعناية ب 40 مل أخرى من محلول المثلج البارد B ثلاثي.

ثم استخدم ملقطا نظيفا لنقل الفلتر على الفور إلى دورق يحتوي على 30 مل من محلول B الثلاثة الطازج ، وقم بإرفاق الأوعية من المرشح مع الرج اللطيف. صب محتويات الدورق في أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل. ثم بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول مثلج البرد B ثلاثة قبل تلطيخ المناعة.

انقل الأوعية إلى أنابيب PCR سعة 0.2 ملليلتر وضع الأنابيب على الجليد حتى ترسب الأنسجة في قاع الأنابيب. ثم استخدم أطراف تحميل الجل لشفط معظم السائل. بعد ذلك ، أدخل شعيرات دموية زجاجية من السيليكون 40 ميكرومتر في طرف ماصة P 200 ، واستخدم الشعيرات الدموية لنقل الأوعية إلى شريحة زجاجية عندما تستقر الأوعية ، قم بإزالة السائل بعناية بقطعة من الورق الماص.

ثم قم بتحميل قطرة واحدة من وسط التثبيت على الأوعية وقم بتطبيق زلة غطاء بزاوية 45 درجة ، مما يسمح لوسيط التثبيت بالانتشار على طول حافة الزجاج حتى يصبح انزلاق الغطاء في مكانه. في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة وضع العلامات المستمرة على RIN حول الخلايا البطانية العصبية مما يؤكد الاحتفاظ بالصفيحة القاعدية على الأوعية المنقاة. يتم الكشف عن مكونات التقاطعات البطانية الضيقة ، مثل ZO one ، على الأوعية المنقاة أيضا.

علاوة على ذلك ، يشير وضع العلامات على الأكتين NG والعضلات الملساء إلى الاحتفاظ بالطفيليات السليمة وخلايا العضلات الملساء الوعائية على التوالي. تم أيضا اكتشاف اتصال بروتينات الغشاء الدبقي الفلكي المحيط بالعقاقير 43 و Aquaporin four على سطح الأوعية المنقاة ، مما يدل على الاحتفاظ الإضافي بأغشية الخلايا النجمية حول الأوعية الدموية أثناء عملية التنقية ، ومع ذلك ، يتم ملاحظة الألياف الموجبة GFAP المشتتة والقصيرة فقط على الأوعية المعزولة التي تكشف عن عدم تنقية أجسام الخلايا النجومية. يبقى عدد قليل فقط من الألياف العصبية متصلة بالأوعية.

وبالمثل ، لم يتم أيضا اكتشاف الخلايا الإيجابية IBA one و oli اثنين مما يؤكد أن الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن لم يتم تنقيتها بشكل مشترك. نوصي بشدة بإزالة الضفيرة الحالية قبل تجانس الدماغ حيث اختبرناها كمصدر محتمل للتلوث ، والعمل في منطقة نظيفة ، وتجنب تلوث الشعر والغبار. حيث أن الأجسام المضادة لها تقارب غير محدد عالي لهذه المواد.

من المهم أيضا إجراء تلطيخ نووي أيضا. من الممكن إزالة خلايا الدم من الأوعية المنقاة عن طريق إجراء التروية داخل القلب باستخدام PBS قبل استخراج الأوعية الدموية. لقد نجحنا في استخراج الهواء والبروتينات من الأوعية المنقاة بواسطة هذا الإجراء من لوحات الأوعية المحضرة حديثا أو المجمدة.

لقد استخدمنا أيضا مجسات الفلورسنت والفحص المجهري متحد البؤر لدراسة وظيفة النقل البطاني خارج الجسم الحي للأوعية. نتمنى لك حظا سعيدا في تجاربك.