تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

الهدف العام من التجربة التالية هو تمكين القياسات المتكررة للموصلية الهيدروليكية أو نفاذية الماء لجدران الأوعية الدموية الدقيقة في مساريق الجرذ تحت ظروف تجريبية مضبوطة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق قثطرة الأوعية الدموية الدقيقة للسماح بضبط الضغوط الاسموزية والهيدروستاتيكية في التجويف، وللسماح بالتحكم الدقيق في التركيب الكيميائي لسوائل التروية. بعد ذلك، يتم سد الوعاء الدموي ومراقبة حركة خلايا الدم الحمراء المعلقة في سائل التروية، والتي تعمل كعلامات تدفق، داخل التجويف كمؤشرات على تبادل السوائل عبر الوعاء الدموي.

بعد ذلك، يتم تسجيل موقع وسرعة الخلايا الحمراء الواسمة، سواء كانت متجهة نحو موقع الانسداد أو بعيدة عنه. وأخيراً، يتم فك الانسداد وتكرار العملية لإجراء قياسات إضافية، أو يتم إعادة قسطرة الوعاء وتكرار القياسات تحت ظروف متغيرة.

وفي النهاية، يمكن إجراء قياسات مزدوجة للموصلية الهيدروليكية تحت ظروف التحكم وظروف الاختبار لتمكين الاستقصاء الأكثر مباشرة للعوامل التي تنظم نفاذية الأوعية الدقيقة. وتتمثل إحدى مزايا تقنية لانديس (landis) المعدلة لاستقصاء تنظيم نفاذية الشعيرات الدموية في خطوة التروية؛ حيث تتيح التروية الدقيقة قياس نفاذية جدار الأوعية الدقيقة في ظل ظروف يتم فيها التحكم المباشر في تكوين سائل التروية، ومساحة السطح المخصصة للتبادل، وضغط الأوعية الدقيقة.

يمكن لهذه الطريقة أن تعالج التساؤلات المتعلقة بالآليات الخلوية والجزيئية لتنظيم النفاذية في الأوعية الدقيقة التي تمثل الأعضاء السليمة، كما يمكنها توفير مقارنة مع النتائج المستخلصة من الطبقات الأحادية المزرعية للخلايا البطانية، والتي تُستخدم غالباً لاستقصاء تفاصيل الآليات الجزيئية. تقوم جويس كلارك، مديرة المختبر لدينا، بشرح البروتوكول الخاص بنا. لقد كانت جويس مسؤولة عن العديد من التحسينات في هذا البروتوكول خلال فترة عملها هنا كمديرة للمختبر.

للبدء، استخدم جهاز سحب إلكتروني لتشكيل عدة أنابيب شعيرية نظيفة من زجاج البوروسيليكات إلى أنصاف مستدقة، بحيث يكون طول طرف كل منها حوالي سنتيمتر واحد، وذلك باستخدام عجلة تجليخ تعمل بالهواء وورق صنفرة بقطر 0.5 ميكرون مغمور في الماء وحامل ميكروبيبت مضبوط بزاوية 30 درجة من الميل الأفقي للميكروبيبتات. بعد غسل وتجفيف الميكروبيبتات وفقاً للبروتوكول النصي، اختر الميكروبيبتات التي تبلغ فتحتها حوالي 50 ميكرون وتتراوح نسبة طول الميل إلى عرضه بين 3.1 و 3.5. كما يجب أن تكون ذات نقطة مستدقة بحدة، مما يساعد في اختراق ألياف الكولاجين القوية في المساريق.

لصنع المثبتات، يتم تعريض طرف شعيرية زجاجية مسحوبة غير مشطوفة لفترة وجيزة لهب دقيق لتشكيل نهاية غير مدببة. تكرر هذه العملية لصنع عدة مثبتات وتُحفظ في صندوق خالٍ من الغبار. بعد ذلك، يتم صنع السدادات الدقيقة عن طريق إمساك أنبوب شعيري مسحوب غير مشطوف بزاوية تحت لهب دقيق، واستخدام محول أنابيب أو ماصة دقيقة مكسورة لثني الأنبوب برفق على بعد حوالي 4 mm من الطرف بزاوية تقارب 120 درجة.

فيما يتعلق بعمود القسطرة، من المهم ألا تكون الطرف مختومة بفعل اللهب ولا مكسورة. بعد تخدير الجرذ وترتيب أنسجة المساريق والأمعاء وفقاً لبروتوكول النص، ضع صينية الحيوان على منصة المجهر بحيث تكون المساريق مرئية من خلال العدسات العينية. ضع خط تقطير يعمل بالجاذبية يحتوي على محلول رينجر للثدييات لضمان التروية المستمرة.

ثم يتم استخدام وسادات شاش لتثبيت الأمعاء في مكانها، والمساعدة في الاحتفاظ بالرطوبة وامتصاص سائل رينجر الزائد من السطح، مع ضبط التدفق وشفط السوائل النضحية للحفاظ على طبقة ثابتة من سائل رينجر، ثم يتم تحديد الأوعية الدموية الدقيقة المستهدفة، وهي الأجزاء غير المتفرعة الموجودة في اتجاه التدفق بعد نقاط التقاء التدفق، والتي تلي الشعيرات الدموية الحقيقية بتفرع واحد أو تفرعين. ابحث عن وعاء غير متفرع يتميز بتدفق دم سريع وخالٍ من الخلايا البيضاء الملتصقة بجدار الوعاء. قم بوضع الأوعية الدقيقة المراد اختبارها في مركز مجال المجهر، وحرك أداة التثبيت إلى الموقع القريب من موضع القسطرة المختار.

لتعبئة الماصة الدقيقة، اسحب كمية من كريات الدم الحمراء المنفذة والمغسولة إلى حقنة مُعدة وفقاً للبروتوكول النصي، مع التأكد من عدم وجود فقاعات في الأنبوب. أدخل الأنبوب في الطرف العريض من الماصة الدقيقة حتى يلامس المنطقة المستدقة. اضغط ضغطة خفيفة وسريعة على مكبس الحقنة لتعبئة طرف الماصة الدقيقة.

ستظهر دفقات صغيرة أو قطرة عند الطرف عندما تمتلئ الماصة. وأثناء سحب الأنبوب، اضغط برفق على المكبس لملء ساق الماصة الدقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الفقاعات الصغيرة الموجودة في الساق عن طريق نقرها برفق.

بعد ذلك، ضع الماصة الدقيقة في حامل ماصات مزود بفتحة جانبية تسمح بتوصيل سائل مستمر بمانومتر مائي. تأكد من ضبط الحامل، المتصل بمحرك هيدروليكي ومتحكم دقيق، بزاوية أفقية طفيفة بحيث لا يصطدم طرف الماصة الدقيقة المستدق بالأمعاء أو بالصينية. وباستخدام حقنة أو مصاصة مطاطية مملوءة بالماء، اضبط الضغط الهيدروستاتيكي المطبق على السائل في الماصة الدقيقة عن طريق تغيير ارتفاع السائل في العمود المائي للمانومتر إلى حوالي 40 centimeters من الماء فوق المساريقا.

قبل وضع الماصة الدقيقة المملوءة تحت المجهر، اضغط بلطف بالمثبت على النسيج بالقرب من الأوعية الدقيقة، مع تطبيق قوة كافية للإمساك بالنسيج، ثم اسحب المثبت للخلف قليلاً لشد النسيج على امتداد الأوعية الدقيقة بحيث تتماشى الإجهادات في ألياف الكولاجين المساريقية مع الوعاء. قم بمحاذاة الماصة الدقيقة مع الوعاء وأنزلها حتى تصبح مرئية من خلال العدسات العينية. ضع الطرف مباشرة قبل موقع القسطرة المختار وأنزله على النسيج بحيث يعيق التدفق داخل الوعاء جزئياً، دون أن يسده تماماً.

باستخدام المحرك الهيدروليكي، قم بتأقين الوعاء عن طريق دفع طرف الماصة ببطء داخل تجويف الوعاء، مع الحرص على عدم دفع الطرف عبر الجانب الآخر من الوعاء. ومع دخول الماصة الدقيقة إلى التجويف، سيقوم سائل التروية بغسل الدم بسرعة من تجويف الوعاء والدخول في الدورة الدموية. خفّض ضغط التروية عن طريق ضبط المانومتر حتى تتذبذب الخلايا الحمراء بلطف داخل تجويف الوعاء.

يحدد هذا الإجراء ضغط التوازن، والذي يقيس الضغط الهيدروستاتيكي للأوعية الدقيقة أو PC عند الطرف القاصي لقطعة الأوعية الدقيقة. حافظ على تروية الوعاء الدموي فوق ضغط التوازن هذا لإجراء الانسداد الدقيق. ضع السدادة فوق الوعاء المروى بالقرب من الحافة السفلية لمجال المجهر باستخدام الفيديو والصوت.

سجل شفهياً موقع نقطة الغلق كما تظهر في القطعة I الحمراء. نقطة الغلق هي 57 مع وضع طرف السدادة فوق الوعاء الدقيق مباشرة. استخدم التحكم الدقيق في المحور Z للمناول الدقيق لخفض السدادة برفق حتى يتم سد التدفق في الوعاء.

استخدم الصوت لتسجيل ضغط المانومتر. الضغط هو 50. ثم قم بتطبيق الانسداد لمدة تتراوح من 3 إلى 10 ثوانٍ ثم حرره.

لاستعادة التروية الحرة، قم بتحريك موقع الانسداد للأعلى في الوعاء باتجاه طرف الماصة بخطوات تتراوح من 5 إلى 10 ميكرون، مع إجراء ما لا يزيد عن ثلاث إلى خمس عمليات سد في كل موقع لمنع تلف جدار الوعاء عند موقع الانسداد. قم بتحليل البيانات وفقاً للبروتوكول النصي. يقيس هذا المخطط الزمني التغيرات في الموصلية الهيدروليكية أو LP. في أوعية دقيقة من شريان مساريقي لجرذ تم قسطرتها بنجاح باستخدام أربع وصلات تروية.

استُخدم مقدار LP عند ضغط ثابت لقياس التغيرات في الأوعية الدقيقة. نفاذية الجدار عند التروية بـ 1%BSA كعينة ضابطة مقابل 10 molar من العامل الالتهابي Brady Kinin أو bk. كما هو موضح هنا، تسبب BK في زيادة عابرة في LP عادت إلى مستويات العينة الضابطة في غضون 10 إلى 15 دقيقة.

بعد إعادة تأسيس مستويات الأساس باستخدام 1%BSA بتركيز 10 nanomolar، تمت إعادة تروية BK بالتزامن مع إضافة pH scene one phosphate أو S one P بتركيز one micromolar. وتُشير النتائج إلى أن S one P قد خفف بشكل ملحوظ من الاستجابة لـ bk. وفي بعض التصاميم التجريبية، من المهم تقدير كل من معامل انعكاس المذاب لجزيء ضخم و lp.

يتم إنجاز ذلك على أفضل وجه من خلال قياس JV عند ضغوط متعددة في كل وعاء دقيق على حدة. وقد قدرت هذه التجربة كلاً من LP والضغط الجرمي الفعال لـ 5%albumin في PERFUSE eight عندما لم يكن هناك albumin في الأنسجة المحيطة بالأوعية الدقيقة. تم قياس JV عبر S عند ثلاثة ضغوط مختلفة وتم تمثيلها بيانياً هنا.

يمثل LP ميل العلاقة بين JV عبر S والضغط، بينما يمثل التقاطع مع محور الضغط فرق الضغط الأسموزي الفعال عبر جدار الوعاء. عند دمجها مع تقنيات أخرى مثل الوسم المناعي الفلوري والمجهر البؤري، أو حتى المجهر الإلكتروني النافذ، يوفر التروية الدقيقة تحليلاً قوياً للبطانة الوعائية الدقيقة ووظائفها باستخدام أوعية ذات نفاذية معروفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء قياسات متكررة للموصلية الهيدروليكية أو نفاذية الماء في الأوعية الدقيقة لمساريق الجرذ تحت ظروف تجريبية محكومة.

يمكنك استخدام هذا النهج في نماذج الجرذان المتاحة حالياً، ولكنني مهتم بشكل خاص بإمكانية استخدامه في سلالات جديدة من الجرذان المعدلة وراثياً والتي ستصبح متاحة بفضل تقنية CRISPR Cas nine، وآمل أن يتم توسيع نطاق استخدامه بهذا الشكل.