VDJ تسلسل: تحليل تسلسل عميق من سلسلة ترتيبها المناعي الثقيلة جين لكشف أنماط نسيلي تطور سرطان الغدد الليمفاوية B الخليوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف التركيب النسيلي لعينات اللمفوما لتحديد أنماط التطور النسيلي في انتكاس اللمفوما. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال اللمفوما، مثل كيفية نشأة الأورام المنتكسة من الأورام الأصلية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه يوظف أحدث تقنيات التسلسل عالي الإنتاجية للسماح برسم خرائط أكثر شمولاً للقواسم المشتركة في اللمفوما.

في هذا البروتوكول، سيتم استخلاص DNA من مقاطع رقيقة لأنسجة طبيعية أو خبيثة، سواء كانت مثبتة في OCT المجمد أو مثبتة بالفورمالين والبارافين، وذلك لاستخلاص DNA من الأنسجة المضمنة في OCT المجمد. أولاً، يتم هضم من 10 إلى 30 مقطعاً رقيقاً في 4 mL من صبغة تحلل الحمض النووي مع protase K و 0.625% SDS في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، يُضاف 1 mL من كلوريد الصوديوم المشبع بتركيز 5 M إلى خليط الهضم ويُرَج بقوة لمدة 15 ثانية، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي عند 1,100 ×g لمدة 15 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة، انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر. أضف حجمين من الإيثانول بتركيز 100% واخلط عن طريق قلب الأنبوب من ست إلى ثماني مرات، ثم قم بالطرد المركزي عند 5,000 ×g لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. ولجمع الحمض النووي (DNA) المترسب، اغسل كتلة الـ DNA مرتين باستخدام إيثانول بتركيز 70% مع إجراء طرد مركزي عند 5,000 ×g لمدة 15 دقيقة في كل مرة.

لجمع الراسب، قم بإذابة راسب DNA في 100 إلى 400 µL من منظم TE في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز طوال الليل لاستخلاص DNA من المقاطع الرقيقة للأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين. أولاً، قم بإزالة البارافين عن طريق تحضين مقاطع البارافين في 1 mL من الزيلين مرتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في كل مرة. اجمع مقاطع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي بسرعة 13,000 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة بقايا الزايلين عن طريق تحضين المقاطع في 1 mL من 100% Ethanol مرتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في كل مرة. اجمع مقاطع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي بسرعة 13,000 ×g لمدة خمس دقائق. اترك المقاطع لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة.

أضف محلول بروتياز (protease case) مُحضّر حديثاً إلى العينات ليكون الحجم النهائي من 50 إلى 100 µL، ثم حضّنها طوال الليل عند 37 °C. في اليوم التالي، سخّن العينات عند 95 °C لمدة 10 دقائق لتعطيل مفعول البروتينيز. تتراوح كمية الـ DNA المستخلصة من عمليات الاستخلاص الموضحة في الجزء السابق من 5 إلى 200 µg اعتماداً على حجم النسيج.

تتمثل الخطوة التالية في تقييم جودة كل عينة DNA في مزيج أنبوب PCR. ضع 25 µL من TDNA polymerase مع 45 µL من master mix من طقم ladder تجاري. أضف 5 µL من DNA إلى أنبوب PCR وامزج جيداً عن طريق السحب والضخ بالممصّة خمس مرات على الأقل.

قم بتضخيم الحمض النووي DNA وفقاً للشروط المفصلة في نص البروتوكول. بعد ذلك، اخلط 20 µL من تفاعل PCR مع 4 µL من صبغة التحميل (loading dye) بتركيز 6x، ثم قم بتحميل المزيج على هلام أغاروز بتركيز 2%. عند اكتمال عملية الفصل الكهربائي، صبغ هلام الأغاروز ببروميد الإيثيديوم (Ethereum bromide) والكشف عن نواتج PCR.

باستخدام نظام تصوير الهلام، سيتم استخدام العينات التي تعطي خمسة نواتج PCR بأحجام 100 و200 و300 و400 و600 زوج قاعدي لتوليد مضاعفات VDJ فقط. سيتم توضيح تضخيم قطعة I-G-H-V-D-J المعاد تركيبها من منطقة الإطار الأولى أو IGV HFR one في هذا الفيديو. يتبع تضخيم قطعة I-G-H-B-D-J المعاد تركيبها من منطقة الإطار الثانية إجراءً مماثلاً، وهو موصوف في نص البروتوكول داخل خليط أنبوب PCR.

أضف 45 µL من المزيج الرئيسي (master mix) من الأنبوب المسمى "mix two" من مجموعة فحص طفرات IGH HYPERMUTATION الجسدية التجارية للكشف بواسطة الهلام، و 0.25 µL من Taq DNA polymerase و 5 µL من عينة DNA. قم بتضخيم الـ DNA وفقاً للشروط الموضحة في نص البروتوكول. ولتضخيم الـ DNA غير المثالي، يمكن تعديل ظروف PCR عن طريق تمديد وقت التلدين (annealing time) أو زيادة عدد دورات التضخيم. قم بفصل نواتج PCR بالكامل عن طريق الترحيل الكهربائي على هلام AGROS بتركيز 2%. صبغ هلام AGROS بمحلول بروميد الإيثيديوم بتركيز 0.5 µg/mL والكشف عن نواتج PCR.

باستخدام نظام تصوير الهلام، يُتوقع ظهور ناتج تضخيم أحادي النسيلة يتراوح حجمه بين 310 إلى 380 زوجاً قاعدياً. قم باستئصال جزء الهلام الذي يحتوي على ناتج التضخيم أحادي النسيلة. بعد ذلك، قم بتنقية الحمض النووي DNA من الجزء المستأصل من الهلام باستخدام طقم استخلاص الهلام قياسي وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

لبدء هذا الإجراء، انقل منتج V-D-J-P-C-R المنقى إلى أنبوب PCR وأضف منظم التعليق Resus من طقم تحضير عينات DNA لزيادة الحجم إلى 60 microliters. أضف 40 microliters من مزيج إصلاح النهايات من طقم تحضير عينات DNA وامزج جيداً، ثم حضّن التفاعل عند 30 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة في جهاز دورة حرارية مسخن مسبقاً مع غطاء مسخن مسبقاً عند 100 degrees Celsius. بعد ذلك، امزج 136 microliters من الحبيبات المغناطيسية و24 microliters من ماء بدرجة PCR في أنبوب سعة 1.5 milliliter، وانقل تفاعل إصلاح النهايات بالكامل إلى الأنبوب وامزجه جيداً مع محلول الحبيبات.

ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقتين للسماح بانفصال الحبيبات عن المحلول. اسحب السائل الطافي واغسل الحبيبات مرتين باستخدام إيثانول 80% مُحضّر حديثاً. اسحب محلول الإيثانول تماماً واترك الحبيبات تجف في الهواء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور 15 دقيقة، انزع الأنابيب من الحامل المغناطيسي وأعد تعليق الخرزات في 17.5 µL من Resus Suspension Buffer. ضع الأنابيب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين لفصل الخرزات عن Resus Suspension Buffer. انقل Resus Suspension Buffer، الذي يحتوي الآن على ناتج إصلاح النهايات، إلى أنبوب PCR نظيف.

تتمثل الخطوة التالية في إضافة ذيل a إلى ناتج إصلاح النهايات. أضف 12.5 microliters من خليط إضافة ذيل a إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على ناتج إصلاح النهايات واخلط جيداً. يتم تحضين أنابيب PCR عند 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة في جهاز دورة حرارية (thermocycler) مسخن مسبقاً مع غطاء مسخن مسبقاً عند 100 degrees Celsius.

لإجراء ربط المهايئ (adapter ligation)، أضف 2.5 µL من منظم تعليق Resus، و2.5 µL من خليط الربط (ligation mix)، و2.5 µL من مؤشر مهايئ DNA إلى تفاعل إضافة ذيل A. حضّن التفاعل عند 30 °C لمدة 30 دقيقة في جهاز تدوير حراري مسخن مسبقاً مع غطاء مسخن مسبقاً عند 100 °C. بعد مرور 30 دقيقة، أضف 5 µL من منظم إيقاف الربط إلى كل تفاعل وامزج جيداً.

أضف 42.5 µL من الخرزات المغناطيسية المخلوطة جيداً إلى كل تفاعل، ثم اغسلها بـ 80% ethanol كما هو موضح سابقاً. أضف 50 µL من Resus suspension buffer لاسترداد ناتج ربط المهايئ. قم بتنقية ناتج ربط المهايئ للمرة الثانية باستخدام 50 µL من خرزات ampu XP المخلوطة جيداً، ثم استرد الناتج في 25 µL من Resus Suspension Buffer داخل أنبوب PCR نظيف.

لتضخيم ناتج VDJ Amplicon، أضف 5 µL من مزيج بادئات PCR و 25 µL من المزيج الرئيسي لـ PCR (PCR master mix) إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على ناتج ربط المهايئ (adapter ligated product) واخلط جيداً، ثم قم بإجراء عملية التضخيم في جهاز التدوير الحراري وفقاً للشروط المذكورة في نص البروتوكول. عند اكتمال التضخيم، قم بتنقية التفاعل باستخدام 50 µL من الخرزات المغناطيسية المخلوطة جيداً، ثم استخلص الناتج النهائي في 30 µL من Resus Buffer. بعد ذلك، يتم التحقق من مكتبة VTJ Amplicon، وتجميعها، وتسلسلها كما هو موضح في نص البروتوكول.

نظرًا لأن تعقيد مكتبة تسلسل VVG منخفض، نوصي بإضافة نسبة من 20 إلى 50% من عينات التسلسل المعتمدة (spiking) للسماح باستدعاء دقيق للقواعد. وتُظهر صور الهلام (gel) التمثيلية هذه نواتج تضخيم V-D-J-P-C-R من الحمض النووي DNA المستخلص من عينات مرضى الليمفوما. وقد تم تقييم جودة ناتج تضخيم V-D-J-P-C-R قبل وبعد بناء المكتبة باستخدام جهاز bioanalyzer.

يشير التحول في الحجم من 334 زوجاً قاعدياً إلى 459 زوجاً قاعدياً إلى إضافة المهايئ لتتبع التطور النسلي لحالة انتكاس لسرطان اللمفوما بائية الخلايا الكبيرة المنتشرة. وقد تم إجراء تحليل تطوري لملفات الطفرات المفرطة الجسدية (SHM) لإعادة ترتيبات VDJ الرئيسية للسلسلة الثقيلة بين عينات التشخيص والانتكاس.

لوحظ نمط التطور النسيلي المتباين المتأخر. كما تم تطوير طرق بيانية جديدة لتصور التطور النسيلي. تمثل الأنماط الموضحة مخططات القياس متعدد الأبعاد لنموذج انتكاس متباين متأخر ونموذج انتكاس متباين مبكر.

يشير نصف قطر كل دائرة إلى عدد النسخ الفرعية المتوافقة مع ملف SHM محدد. يمثل اللون الأزرق عينة التشخيص، بينما يمثل اللون الأحمر عينة الانتكاس. وبالمثل، تظهر الرسوم البيانية غير الموجهة أن توزيع أعداد النسخ الفرعية في حالة التباعد المتأخر يختلف عن حالة التباعد المبكر.

تمثل الحواف ملفيْن شخصيين للطفرات الجسدية المفرطة (SHM) تفصل بينهما مسافة حرف واحد، ويشير شريط مقياس الألوان إلى نسبة التسلسلات التي تتطابق مع ملف SHM محدد، سواء كانت مرتبطة بعينة التشخيص الحمراء أو عينة الانتكاس الصفراء. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تجنب التلوث الخلطي بين العينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم جودة عينات أورام الليمفوما.

يمكن استخدام هذا النهج أيضاً لتتبع المرض المتبقي الأدنى وفحص استجابة المراقبة المناعية للسرطانات. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.