عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام تقنية قياس استهلاك الأكسجين القائمة على الأطباق الدقيقة لتقييم وظيفة سلسلة نقل الإلكترونات، ودورة TCA، ومسار أكسدة بيتا، وناقلات الركيزة. ويتحقق ذلك أولاً من خلال تحضير الركيزة ومحاليل الحقن الخاصة بالمقايسة. وتتمثل الخطوة الثانية في إضافة محاليل الحقن إلى خرطوشة مقايسة tric تم ترطيبها مسبقاً لمعايرة جهاز قياس استهلاك الأكسجين.

بعد ذلك، قم بتحضير محاليل الركيزة الميتوكوندرية ووضع هذه المحاليل في طبق زراعة الخلايا. قم بتدوير طبق زراعة الخلايا للسماح بالتصاق الميتوكوندريا بوسط الطبق قبل وضع الطبق في جهاز قياس التنفس. يتم الحصول على نتائج الجهاز التي توضح معدلات استهلاك الأكسجين بناءً على التنفس الميتوكوندري لكل اختبار قياس تنفس.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل قطب كلارك (Clark Electrode)، في أن التقنيات القائمة على الأطباق ذات الآبار الصغيرة تتيح الحصول على قياسات لاستهلاك الأكسجين بكفاءة أعلى وإنتاجية أكبر باستخدام كميات أقل من الميتوكوندريا؛ وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة بسبب تعدد الخطوات والعمليات المطلوبة لتحضير محاليل المقايسة. في الليلة التي تسبق التجربة، يتم ترطيب خرطوشة مقايسة tric في 1 mL من محلول المعايرة داخل حاضنة غير مزودة بـ CO2 عند 37 °C. وفي اليوم التالي، تُخرج جميع السيقان المجمدة وتُذاب في حمام مائي أو حاضنة عند 37 °C. بعد ذلك، يتم تحضير جميع محاليل الركيزة ومحاليل الحقن وتخزينها على الثلج. وتتمثل الخطوة التالية في برمجة جهاز قياس استهلاك الأكسجين متعدد الآبار وفقاً لمعايير الوزن والخلط والقياس المناسبة.

قم بتشغيل برنامج التحليل واختر الوضع القياسي. ادخل إلى منتدى ضيف seahorse وانقر على معالج المقايسة (assay wizard). وبمجرد الدخول إلى معالج المقايسة، انقر على البروتوكول لتغيير وزن الخليط ومعلمات القياس.

قم بتسمية آبار الخلفية تحت علامة تبويب تصحيح الخلفية وتأكد من تحديدها. ثم قم بإجراء تصحيح الخلفية. قم بتسمية الظروف من خلال النقر أولاً على علامة تبويب المجموعات والتسميات، تليها علامة تبويب معلومات المجموعة.

بعد إدخال هذه المعلمات، انقر فوق "نهاية" (end) ثم "حفظ القالب" (save template). لبدء هذا الإجراء، قم بتحميل محاليل الحقن في خرطوشة تشغيل المقايسة. احرص على حقن المحاليل في المنافذ الصحيحة.

قم بتركيب خرطوشة تشغيل المقايسة في الجهاز مع توجيه الزاوية ذات الثلمة إلى أسفل اليسار. ابدأ عملية المعايرة عن طريق الدخول أولاً إلى برنامج التحليل، ثم الدخول إلى الوضع القياسي. ادخل إلى منتدى ضيوف seahorse.

افتح القالب المحفوظ في XF Drive تحت علامة تبويب القوالب (templates). بمجرد فتحه، انقر فوق "بدء" (start) لبدء عملية المعايرة، والتي ستستغرق حوالي 30 دقيقة. تم عزل الميتوكوندريا لهذا الإجراء من العضلات الهيكلية الحمراء؛ اخلط مخزون ركيزة الميتوكوندريا بلطف ولكن بدقة عن طريق التحريك برفق وتكرار تقليب المحلول باستخدام طرف ماصة سعة 200 µL تم قص حوالي 3 mm من نهايته.

بعد تحديد تركيز البروتين في المخزون الميتوكوندري، أعد تعليق 10 micrograms من بروتين الميتوكوندريا في 200 microliters من مزيج الركيزة المعروفة بـ succinate. اخلط محلول الميتوكوندريا والركيزة برفق ولكن بشكل شامل عن طريق تقليب المحلول بلطف باستخدام طرف ماصة سعة 200 microliter تم قطع حوالي ثلاثة مليمترات من طرفه بنفس الطريقة. كرر العملية باستخدام 14 micrograms من بروتين الميتوكوندريا في 200 microliters من كل مزيج من الركائز المتبقية، ثم ضع جميع مخاليط بروتين الميتوكوندريا والركائز على الثلج.

ضع طبق زراعة خلايا يحتوي على 24 بئراً على الثلج، ثم قم بتحميل 50 µL من كل خليط من ركائز الميتوكوندريا في كل بئر وبثلاث مكررات. يوصي مطورو مقايسة TRIC القائمة على الأطباق الدقيقة بترك بئرين فارغين على الأقل بدون ميتوكوندريا، ويفضل أن يكون ذلك على جانبي طبق زراعة الخلايا. قم بتدوير طبق زراعة الخلايا عند 2000 G لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C لضمان التصاق الميتوكوندريا بالآبار أثناء دوران الطبق.

قم بتدفئة محاليل الركيزة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. بعد اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بتحميل 450 µL من كل محلول ركيزة بعناية فوق الآبار المخصصة لها. تأكد من تحميل اللوحة في درجة حرارة الغرفة.

املأ الآبار الفارغة بـ 500 µL من محلول الفراغ للركيزة. يجب ملء الآبار المخصصة لمقايسة تدفق الإلكترونات بركيزة تدفق الإلكترونات، بينما يمكن ملء آبار محلول الفراغ للمقايسة المقترنة بأي ركيزة مقايسة اقتران. بعد إضافة 450 µL من الركيزة إلى كل بئر، افحص طبقة الميتوكوندريا في البئر بتكبير 20x للتأكد من توزيع الميتوكوندريا بشكل متساوٍ في طبقة أحادية واحدة.

كما هو موضح في هذا المثال، يمكن إزالة آبار الصور التي لا يبدو أن بها طبقة أحادية موزعة بالتساوي بعد مرحلة الـ oc. بعد التأكد من التصاق الميتوكوندريا، انقل طبق زراعة الخلايا إلى جهاز تحليل Respir metric. انقر موافق.

ستقوم الآلة بإخراج لوحة الخدمات التي استُخدمت سابقاً للمعايرة. قم بإزالة لوحة الخدمات ووضع لوحة زراعة الخلايا التي تحتوي على الميتوكوندريا على الصينية. يجب وضع الثلمة الزرقاء الموجودة في لوحة زراعة الخلايا في الزاوية السفلية اليسرى من الصينية.

انقر فوق "متابعة" لبدء تشغيل المقايسة، والتي تستغرق حوالي 40 دقيقة. بعد اكتمال التشغيل، اضغط على "إخراج" على الشاشة لإخراج لوحة زراعة الخلايا. بمجرد إخراج اللوحة، قم بإزالة لوحة زراعة الخلايا والخرطوشة والتخلص منهما.

اضغط على متابعة (continue) في الشاشة. سيتم حفظ التشغيل تلقائياً كملف XLS في ملف البيانات. افتح هذا الملف وقم بتغيير العرض من O2 إلى OCR بالضغط على السهم المتجه لأسفل أسفل علامة Y one.

بعد ذلك، قم بتغيير "middle point" إلى "point to point rates" من ضمن خيارات "rate data displayed". انقر فوق "okay". لتطبيق هذه التغييرات، انقر فوق علامة تبويب "well group mode" الموجودة في أسفل يسار الشاشة لتجميع الآبار ذات الظروف المتشابهة معاً.

أخيراً، انقر فوق علامة تبويب الخطأ المعياري لمتوسط العينة (sample mean standard error) الموجودة باتجاه منتصف الشاشة إلى اليسار. ويمكن أيضاً إعداد هذه الأوامر قبل إجراء المقايسة. تمثل هذه الرسوم البيانية معدلات استهلاك الأكسجين أو OCR مقابل الوقت لأربع مقايسات اقتران.

تمثل اللوحة الأولى الحالة الثانية، وهي التنفس أو التنفس في غياب الفسفات المضاف (DP). أما اللوحة الثانية فتمثل التنفس المقترن الأقصى بعد حقن الفسفات المضاف (DP)، وهو ما يسمى أيضاً بتنفس الحالة الثالثة. وتمثل اللوحة الثالثة التنفس الناتج عن تسرب البروتونات بعد حقن الأولغومايسين (oligo mycin)، ويسمى أيضاً بتنفس الحالة الرابعة.

تمثل اللوحة الرابعة بعد حقن FCCP التنفس غير المقترن الأقصى، والذي يسمى أيضاً التنفس في الحالة الثالثة U. بينما تمثل اللوحة الخامسة بعد حقن antimycin A تثبيط التنفس التأكسدي. وتتميز جميع الحالات الميتوكوندرية بانحراف معياري أدنى نظراً للخلط الشامل للمخزون الميتوكوندري وخليط ركائز الميتوكوندريا، وتحقيق طبقة واحدة من الميتوكوندريا بعد عملية الطرد المركزي للالتصاق.

في المقابل، يؤدي تحميل كميات غير متساوية من الميتوكوندريا في كل بئر وعدم تحقيق طبقة واحدة موحدة من الميتوكوندريا إلى زيادة الانحراف المعياري في كل حالة، كما يظهر في المنحنى الأزرق، الذي يبين قيم OCR تتجاوز 1, 500 ole في الدقيقة، بالإضافة إلى انخفاض معدلات التنفس على مدار فترة القياس، وهو ما يتضح من خلال الهبوط في قيم المعدل من نقطة إلى نقطة. لاحظ أن المنحنى الأحمر يظهر معدلات ثابتة من نقطة إلى نقطة، كما أن قيم OCR القصوى تكون أقل من 1, 500 ole في الدقيقة. يمكن أن يؤدي الإفراط في تحميل بروتين الميتوكوندريا أيضاً إلى استنفاد الأكسجين داخل الغرفة الدقيقة للبئر، مما يمنع القياس الدقيق لـ OCR في كل قياس متتالٍ، كما يشير المنحنى الأزرق، الذي يظهر وصول قيم O2 إلى الصفر تقريباً خلال فترة القياس، بالإضافة إلى انخفاض ملحوظ في قيم O2 الابتدائية بعد كل قياس متتالٍ.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة التحلي بالصبر عند خلط الميتوكوندريا ومحاليل الركائز. وبمجرد إتقان هذه الطرق، يمكن إجراء تجارب إضافية للإجابة على أسئلة أخرى، مثل: كيف تؤثر العلاجات الدوائية التي تستهدف ناقلاً معيناً للركيزة على استهلاك الميتوكوندريا للأكسجين؟