عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام تقنية استهلاك الأكسجين القائمة على الصفيحة الدقيقة لتقييم وظيفة سلسلة نقل الإلكترون ، ومسار أكسدة بيتا لدورة TCA ، وناقلات الركيزة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الركيزة ومحاليل الحقن للفحص أولا. الخطوة الثانية هي إضافة محاليل الحقن إلى خرطوشة فحص tric رطبة مسبقا لمعايرة آلة استهلاك الأكسجين.

بعد ذلك ، قم بإعداد محاليل ركيزة الميتوكوندريا وقم بتحميل هذه المحاليل في لوحة زراعة الخلية. قم بتدوير لوحة زراعة الخلية للسماح بالتصاق الميتوكوندريا باللوحة جيدا قبل تحميل اللوحة في مقايسة Respira المتري. يتم الحصول على نتائج الأدوات التي توضح معدلات استهلاك الأكسجين بناء على تنفس الميتوكوندريا لكل اختبار متري للريسيرو.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل كلارك الكهربائي ، هي أن التقنيات القائمة على الصفيحة الدقيقة تسمح بالحصول على إنتاجية أكثر كفاءة وأعلى لاستهلاك الأكسجين بكميات أقل من الميتوكوندريا ، وعموما سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب جميع الأجزاء المتحركة التي ينطوي عليها إعداد الحلول للفحص في الليلة التي سبقت التجربة خرطوشة فحص الهيدرات في مليلتر واحد من محلول المعايرة في غير حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي ، أخرج جميع السيقان المجمدة وقم بإذابة الثلج في حمام أو حاضنة 37 درجة مئوية. تحضير جميع محاليل الركيزة ومحاليل الحقن وتخزينها على الثلج. الخطوة التالية هي برمجة آلة قياس استهلاك الأكسجين متعددة الآبار على وزن المزيج المناسب وقياس المعلمات.

ادخل إلى برنامج التحليل وحدد الوضع القياسي. ادخل إلى منتدى ضيف فرس البحر وانقر على معالج الفحص. بمجرد دخولك إلى معالج الفحص ، انقر فوق البروتوكول لتغيير وزن المزيج ومعلمات القياس.

قم بتسمية آبار الخلفية أسفل علامة تبويب التصحيح الخلفي وتأكد من تمييزها. قم بتصحيح الخلفية. قم بتسمية الشروط بالنقر أولا على علامة تبويب المجموعات والتسميات، متبوعة بعلامة التبويب معلومات المجموعة.

بعد إدخال هذه المعلمات، انقر فوق إنهاء متبوعا بحفظ القالب. لبدء هذا الإجراء، قم بتحميل محاليل الحقن في خرطوشة تشغيل المقايسة. احرص على حقن المحاليل في المنافذ المناسبة.

قم بتحميل خرطوشة تشغيل الفحص في الجهاز بزاوية مسننة في أسفل اليسار. ابدأ المعايرة بالدخول أولا إلى برنامج التحليل متبوعا بالدخول إلى الوضع القياسي. ادخل إلى منتدى ضيف فرس البحر.

افتح القالب المحفوظ ضمن XF Drive ضمن علامة تبويب القوالب. بمجرد الفتح ، انقر فوق ابدأ لبدء المعايرة ، والتي ستستغرق حوالي 30 دقيقة. تم عزل الميتوكوندريا لهذا الإجراء من العضلات الهيكلية الحمراء برفق ولكن جيدا ، وخلط مخزون ركيزة الميتوكوندريا عن طريق التحريك برفق ، وتكرار المحلول بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر تم قطع نهايته بحوالي ثلاثة ملليمترات.

بعد تحديد تركيز البروتين لمخزون الميتوكوندريا ، قم بتعليق 10 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل 200 ميكرولتر من مزيج الركيزة المعروف بتعفن السكسينات. امزج محلول ركيزة الميتوكوندريا برفق ولكن جيدا عن طريق التقليب برفق مع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر تم قطع نهايته بحوالي ثلاثة ملليمترات بنفس الطريقة. Reeses Band ، 14 ميكروغراما من بروتين الميتوكوندريا لكل 200 ميكرولتر من كل مزيج من خلطات الركيزة المتبقية تضع جميع خلطات ركيزة بروتين الميتوكوندريا على الجليد.

ضع صفيحة ثقافة خلية 24 جيدا على الجليد وفي حمولة ثلاثية 50 ميكرولتر لكل بئر من كل مزيج من خلطات ركيزة الميتوكوندريا. يوصي مطورو مقايسة tric القائمة على الصفيحة الدقيقة بترك ما لا يقل عن بئرين فارغين بدون ميتوكوندريا ، ويفضل أن يكون ذلك على جانبي لوحة زراعة الخلية. قم بتدوير لوحة زراعة الخلايا عند 2000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتلتصق الميتوكوندريا بالآبار أثناء دوران اللوحة.

قم بتسخين محاليل الركيزة في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد اكتمال الدوران ، قم بتحميل 450 ميكرولتر بعناية من كل محلول ركيزة فوق الآبار الخاصة به. تأكد من تحميل اللوحة في درجة حرارة الغرفة.

قم بتحميل الآبار الفارغة ب 500 ميكرولتر من الركيزة فارغة. يجب تحميل الآبار المخصصة لمقايسة تدفق الإلكترون بركيزة تدفق الإلكترون بينما يمكن تحميل الآبار الفارغة للفحص المقترنة بأي ركيزة فحص اقتران. بعد إضافة 450 ميكرولتر من الركيزة إلى كل منها ، اعرض طبقة الميتوكوندريا في البئر بتكبير 20 × لضمان تشتيت الميتوكوندريا بالتساوي في طبقة أحادية الطبقة.

كما هو موضح في هذا المثال، يمكن إزالة آبار الصور التي لا يبدو أنها تحتوي على طبقة أحادية موزعة بالتساوي بعد التمثيل. بعد التأكد من التصاق الميتوكوندريا ، خذ لوحة زراعة الخلية إلى أداة الفحص المتري Respir. انقر فوق موافق.

ستقوم الماكينة بإخراج لوحة المرافق التي تم استخدامها سابقا للمعايرة. قم بإزالة لوحة المنفعة وضع لوحة زراعة الخلايا التي تحتوي على الميتوكوندريا على الدرج. يجب وضع الشق الأزرق الموجود على لوحة زراعة الخلية في الزاوية اليسرى السفلية من الدرج.

انقر فوق متابعة لبدء تشغيل الفحص ، والذي يستغرق حوالي 40 دقيقة. بعد اكتمال التشغيل ، اضغط على إخراج على الشاشة لإخراج لوحة زراعة الخلية. بمجرد إخراج اللوحة ، قم بإزالة لوحة ثقافة الخلية والخرطوشة والتخلص منها.

اضغط على متابعة على الشاشة. سيتم حفظ التشغيل تلقائيا كملف XLS في ملف البيانات. افتح هذا الملف وقم بتغيير الشاشة من O2 إلى OCR عن طريق الضغط على السهم لأسفل أسفل علامة Y واحد.

بعد ذلك ، قم بتغيير النقطة الوسطى إلى معدلات نقطة إلى نقطة ضمن بيانات المعدل المعروضة كخيار. انقر فوق موافق. لتطبيق هذه التغييرات ، انقر فوق علامة التبويب وضع مجموعة الآبار في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة لتجميع الآبار ذات الظروف المتشابهة معا.

أخيرا ، انقر فوق علامة التبويب متوسط الخطأ القياسي العينة في منتصف الشاشة إلى اليسار. يمكن أيضا إعداد هذه الأوامر قبل المقايسة. تمثل هذه التتبع معدلات استهلاك الأكسجين أو التعرف الضوئي على الحروف مقابل الوقت لأربعة فحوصات اقتران.

تمثل اللوحة الأولى الحالة الثانية ، التنفس أو التنفس في حالة عدم وجود DP. تمثل اللوحة الثانية بعد حقن A DP أقصى قدر من التنفس المقترن ، ويسمى أيضا التنفس في الحالة الثالثة. اللوحة الثالثة بعد حقن oligo mycin. يمثل A التنفس الناتج عن تسرب البروتون ، ويسمى أيضا تنفس الحالة الرابعة.

اللوحة الرابعة بعد حقن FCCP أقصى تنفس غير مقترن ، وتسمى أيضا تنفس الحالة الثالثة U. تمثل اللوحة الخامسة بعد حقن مضادات المايسين أ تثبيط التنفس التأكسدي. جميع حالات الميتوكوندريا لها حد أدنى من الانحراف المعياري بسبب الخلط الشامل لمخزون الميتوكوندريا وخلطات ركيزة الميتوكوندريا وتحقيق طبقة أحادية واحدة من الميتوكوندريا بعد دوران الالتصاق.

في المقابل ، يؤدي تحميل الميتوكوندريا غير المتكافئة في كل بئر وعدم الوصول إلى طبقة أحادية واحدة من الميتوكوندريا إلى زيادة الانحراف المعياري في كل حالة ، كما هو موضح في التتبع الأزرق ، والذي يظهر قيم التعرف الضوئي على الحروف فوق 1 ، 500 أولي في الدقيقة ، بالإضافة إلى انخفاض معدلات التنفس على مدار فترة القياس التي يتضح من انخفاض قيم معدل النقطة إلى النقطة. لاحظ أن التتبع الأحمر يظهر معدلات متسقة من نقطة إلى نقطة وأن قيم التعرف الضوئي على الحروف القصوى أقل من 1 ، 500 أولي في الدقيقة. يمكن أن يؤدي الحمل الزائد لبروتين الميتوكوندريا أيضا إلى استنفاد الأكسجين داخل الغرفة الدقيقة للبئر ، وبالتالي منع القياس الدقيق للالتعرف الضوئي على الحروف لكل قياس متتالي كما هو موضح في Blue Trace ، والذي يظهر O2 تقترب القيم من الصفر خلال فترة القياس ، بالإضافة إلى انخفاض كبير في O2 تبدأ قيم بعد كل قياس متتالي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن يكون لديك مرضى عند خلط الميتوكوندريا ومحاليل الركيزة. بمجرد إتقان هذه الطرق ، يمكن تشويه تجارب إضافية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تؤثر العلاجات الموجهة للأدوية لناقل ركيزة معين على استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا؟