عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

الهدف العام من مقال الفيديو هذا هو عزل الميتوكوندريا عالية الجودة عن كميات صغيرة من عضلات الهيكل العظمي للفأر لاستخدامها في فحوصات التريكية القائمة على الصفيحة الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحوث الطبية الحيوية ، مثل وصف كيفية تعديل بعض الأدوية والبروتينات لعضلات الهيكل العظمي واستهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عزل الميتوكوندريا عالية الجودة عن كميات أقل من عضلات الهيكل العظمي للفأر مما تم الإبلاغ عنه سابقا.

إجراء القتل الرحيم للفأر وفقا لإرشادات المؤسسة. ثم ضع الماوس على جانبه واستخدم مقصا ناعما لعمل شق في الجلد. تراكب اللقيمة الجانبية لعظم الفخذ.

قشر الجلد باتجاه الفأر ، ثم قم بإزالة الوسادة الدهنية الموضوعة فوق نقطة أصل عضلات الفخذ. بعد ذلك ، قم بقطع وتر الفخذ المتصل بالرضفة. قص العصاب ببطء بين العظم وعضلات الفخذ مع تجنب الشريان الفخذي.

ثم قم بقطع الوتر عند نقطة الأصل على عظم الفخذ لتحرير عضلة الفخذ ووضع عضلة الفخذ في PBS المبرد. قم بإزالة أي أنسجة دهنية مرئية فوق عضلات الفخذ باستخدام مقص. بمجرد أن تنظيفها ، اقلب عضلات الفخذ بحيث يكون جزء العضلة الذي كان يغطي عظم الفخذ متجها لأعلى.

افتح عضلة الفخذ بالملقط بحركة تهوية. قم بإزالة جزأين من العضلات الحمراء المرئية من كل فص وضعها في دورق يحتوي على خمسة ملليلتر من الميتوكوندريا المبردة. المخزن المؤقت للعزل.

بعد ذلك ، قم بقص الجلد الذي يغطي وتر العرقوب بمقص رفيع الرأس وقشر الجلد باتجاه الفأر. قطع وتر العرقوب المكشوف وقشر العضلات باتجاه جسم الفأر. اقطع الوتر عند اللقمة الجانبية والإنسية لعظم الفخذ لتحرير المعدة ووضع المعدة المرفقة بأوتارها في طبق مليء ب PBS المبرد.

اقلب المعدة وقشر العضلة الوحيدة. ضع العضلة الوحيدة في الدورق الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من الميتوكوندريا المبردة. المخزن المؤقت للعزل.

فتحت إحدى المروحات التالية المعدة وأزالت أجزاء العضلات الحمراء الثلاثة المرئية. سيكون هناك جزءان جانبيان وشريط أحمر سطحي وسطي. بمجرد عزلها ، انقل العضلة الحمراء إلى الدورق الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من الميتوكوندريا المبردة.

عازل العزل الأول. قم بإزالة 75 إلى 100 ملليغرام أخرى من العضلات الحمراء من الساق الأخرى للماوس. تكرار العملية الموضحة للتو.

ضع العضلة المقطعة من الساق الثانية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر مع كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز ومخزن تحلل الخلايا المحضر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. وميض على الفور ، قم بتجميد العينة الثانية في النيتروجين السائل لاستخدامها في النشاف الغربي. ضع سطحا بلاستيكيا مسطحا مسبقا على الثلج في دلو كبير.

ثم اسكب قطرة من عازل الميتوكوندريا على السطح البلاستيكي ، واستخدم الملقط لوضع كل العضلات الحمراء المقطعة في قطرة من العزلة. مخزن مؤقت. افرم الأنسجة العضلية لمدة دقيقتين باستخدام شفرات حلاقة أحادية الحافة ، وقم بتغييرها إلى ماكينة حلاقة حادة جديدة كل 40 ثانية. انقل الأنسجة المفرومة إلى دورق جديد مع خمسة ملليلتر من الميتوكوندريا الطازجة.

عازل العزل الأول. ثم خذ المحلول وصفيه من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون ، توضع على أنبوب مخروطي سعة 50 مل. امسح الأنسجة بممسحة مهمة دقيقة ، ثم انقلها إلى خمسة ملليلتر من محلول 0.05٪tryin.

استخدم الملقط لإزالة أي أنسجة متبقية من ممسحة المهام وإضافتها إلى التربسين. احتضان الأنسجة العضلية في محلول التربسين على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، صب التربسين في حاوية النفايات وأعد تعليق الحبيبات بثلاثة ملليلتر من عازل الميتوكوندريا المثلج البارد. ثم انقل الأنسجة إلى أنبوب الخالط الزجاجي سعة 45 مل. اشطف الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر بسعة 1.5 مل أخرى من عازل الميتوكوندريا لجمع أي عينة متبقية وإضافتها إلى أنبوب الخالط الزجاجي.

بعد ذلك ، ضع أنبوب الخالط الزجاجي في دورق أو وعاء بلاستيكي مملوء في منتصف الطريق بالثلج. لذلك يتحرك الخالط الزجاجي بشكل ضئيل داخل الدورق قم بتجانس العينة بمدقة بولي تترافلورو إيثيلين متصلة بنسيج يعمل بمحرك.

الخالط مع 10 في 80 دورة في الدقيقة. استمر في الجزء السفلي من كل تمريرة لمدة ثانيتين تقريبا. ثم انقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا.

واشطف أنبوب الخالط الزجاجي ب 6.5 مل من عازلة عزل الميتوكوندريا واحدة. صب المخزن المؤقت في الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر الذي يحتوي على بقية الأنسجة. متجانس. قم بتدوير العينة عند 700 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم اسكب السوبينات برفق في أنبوب طرد مركزي زجاجي عالي القوة وتخلص من الحبيبات.

بعد ذلك ، قم بتدوير snat عند 8 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لحبيبات الميتوكوندريا ، قم بإزالة السنات وإعادة تعليق الحبيبات عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من عازل الميتوكوندريا ببطء ، وقطع نهاية طرف الماصة وتجانس الحبيبات برفق في المخزن المؤقت بحركات الخلط والتقليب. ثم أضف 4.5 مل أخرى من عزل الميتوكوندريا.

قم بتخزين اثنين في الخليط بعد تعليق الحبيبات بالكامل ، قم بتدوير المتجانس عند 8 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتكميل الميتوكوندريا مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية S وأعد تعليق الحبيبات برفق ولكن تماما عن طريق إضافة 2 25 ميكرولتر من عزل الميتوكوندريا. قم بتخزين اثنين ، باستخدام طرف ماصة مع قطع نقطتها ، وحرك الحبيبات برفق واخلطها بعد كل إصدار من 25 ميكرولتر من العازلة.

عند الانتهاء ، ضع مخزون الميتوكوندريا هذا على الثلج. اصنع تخفيفين منفصلين من مخزون الميتوكوندريا في ماء عالي النقاء. أضف 0.1٪ من Triton 100 x إلى عينة واحدة وصوتنة لمدة 10 ثوان عند إعداد منخفض.

اترك التخفيف الآخر على الجليد وأعد العينة المصوتة إلى الثلج. بعد الصوتنة ، ثم قم بإجراء اختبار سينسيز السترات مع كل من تخفيف الميتوكوندريا غير المونيجات الصوتية والصوتنة باستخدام الفحص الضوئي باستخدام التقنيات القياسية ، وتحديد النسبة المئوية لأغشية الميتوكوندريا السليمة باستخدام المعادلات المنصوص عليها في بروتوكول النص المصاحب. يؤدي تجميع الميتوكوندريا إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في نشاط سينتاز السترات.

يظهر نشاط سينتاز السترات في عينات الميتوكوندريا غير الصوتية مقارنة بالعينات الصوتية أن 92.5٪ من الميتوكوندريا كانت سليمة بعد التعبير عن العزلة ل ga. DH و COX أربعة واضحان في تحلل الأنسجة بأكملها في التعبير عن الميتوكوندريا المعزولة لكوكس فور. في حين أن النطاقات الباهتة فقط من GA DH واضحة ، فإن هذه النتائج تشير إلى عزلات جيدة للميتوكوندريا مع القليل من التلوث من المكونات غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع مخزون الميتوكوندريا بعناية ، وعدم تدويره أو خلطه بقوة باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس إنتاج أنواع التأثير التفاعلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان التدخل يؤثر على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الميتوكوندريا المعزولة.